本文關鍵詞：LPS對卵泡顆粒層和膜層細胞Toll受體基因表達和類固醇激素合成的影響

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【摘要】：為研究種鵝等級卵泡的病原識別模式受體和內分泌功能對細菌內毒素(LPS)的反應性,探討Toll樣受體(TLRs)在種鵝生殖免疫中的作用及其與生殖內分泌的關系,以加深對生殖系統(tǒng)感染和生殖調控的理解,尋找有效的治療方法和免疫新靶位,我們以產蛋期揚州鵝為實驗動物,在種鵝產蛋后8h和2h以及產蛋前4h、16h和28h翅靜脈注射LPS(1.5 mg/kg BW),在其產蛋8h后翅靜脈采集血液,并屠宰采集卵巢卵泡,觀察卵泡外觀形態(tài),分離等級卵泡的膜層和顆粒層。采用實時熒光定量PCR(q RT-PCR)和放射免疫分析法等技術分別研究種鵝產蛋期卵泡顆粒層(GL)和膜層(TL)的TLRs表達譜及表達差異;TLRs在不同生長期卵泡GL和TL的表達差異;LPS處理0h,6h,12h,24h和36h后卵泡外觀形態(tài)的變化及GL和TL TLRs的表達變化,以及血液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)的濃度及其合成限速酶基因類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白(St AR),膽固醇側鏈裂解酶基因(CYP11A1),17ɑ-羥化酶和17,20裂解酶基因(CYP17A1),細胞色素P450芳香化酶基因(CYP19A1)的表達變化。結果顯示,顆粒細胞中,除了TLR2-2幾乎不表達,其余所有的TLRs成員,包括TLR1-1,TLR1-2,TLR2-1,TLR3,TLR4,TLR5,TLR7,TLR15和TLR21都表達;膜細胞則表達所有禽類TLRs成員。產蛋期種鵝,4個TLRs家族基因在GL中的表達水平極顯著高于TL(P0.01),3個TLRs成員在TL的表達量極顯著高于GL(P0.01)。隨著卵泡的生長發(fā)育,各個TLRs的表達水平相對較穩(wěn)定,僅TLR15在GL中的表達水平隨卵泡發(fā)育而增強(P0.05),TLR2-1和TLR15在TL中的表達水平隨卵泡發(fā)育顯著增強(P0.05)。LPS處理12小時內,等級卵泡外觀形態(tài)無明顯變化,24h時,部分鵝卵泡出現不規(guī)則的膠凍狀變性,而36h時,所有實驗鵝卵泡皆出現膠凍狀變性。GL中8個TLRs家族基因的表達水平隨LPS作用時間增加而顯著增強(P0.01),而TLR3的表達水平呈現減弱的趨勢,這些TLRs出現差異顯著的時間點不同。與在GL不同的是,TL中,10個TLRs家族基因在LPS作用后其表達水平都逐步增強,并于不同時間點達到差異極顯著(P0.01)。LPS處理后,鵝血液中P4和E2的濃度顯著降低(P0.01),都于12h時達到差異顯著,而其合成限速酶基因St AR和CYP11A1,CYP17A1和CYP19A1的表達也減弱,分別于6h,6h,12h和6h時發(fā)生顯著改變(P0.01),其中St AR的表達水平呈現先增強后減弱的趨勢。綜合上述試驗結果表明,種鵝卵泡中表達各個TLRs家族基因,存在TLRs介導的先天性免疫反應。顆粒細胞和膜細胞對不同病原微生物的敏感性不同,其潛在的抵御病原微生物的能力也不同。隨著種鵝卵泡的生長發(fā)育,顆粒細胞和膜細胞的病原識別能力增強。LPS直接危害卵泡發(fā)育及排卵,所有禽類TLRs家族基因的表達水平都隨之發(fā)生顯著變化,并可分為早期,中期和后期應答基因,早期卵泡損傷小,是治療LPS入侵的最佳時期。此外,LPS還降低P4和E2的合成及其關鍵限速酶基因的表達,危害鵝的生殖內分泌�；谘芯拷Y果,我們推測LPS入侵后,卵泡通過TLRs介導性類固醇激素的合成,且這一過程可能存在時間依賴性。本研究對水禽業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境的控制及開發(fā)內毒素抑制劑、新型減毒疫苗和佐劑可提供參考,對水禽生殖免疫和生殖內分泌,及兩者之間關系進行了初步探討,為其深入研究奠定基礎。
【關鍵詞】：鵝 等級卵泡 Toll樣受體 內毒素 性類固醇激素合成
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S835
【目錄】：

• 符號說明5-9
• 中文摘要9-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-28
• 1.1 TLRs的概述14-21
• 1.1.1 TLRs的結構14-15
• 1.1.2 TLRs的配體15
• 1.1.3 TLRs的分布15-16
• 1.1.4 TLRs信號轉導途徑16-18
• 1.1.5 TLRs在免疫系統(tǒng)中的作用18
• 1.1.6 TLRs與生殖免疫調節(jié)18-21
• 1.2 LPS的概述21-25
• 1.2.1 LPS的結構21-22
• 1.2.2 LPS的受體22-23
• 1.2.3 LPS的信號通路23-24
• 1.2.4 水禽養(yǎng)殖環(huán)境LPS的來源24-25
• 1.2.5 LPS對種鵝的危害25
• 1.3 P4、E2與其合成關鍵限速酶基因的概述25-27
• 1.4 TLRs與P4、E2的關系27-28
• 1.5 本研究的目的意義28
• 2 材料與方法28-36
• 2.1 材料28-29
• 2.1.1 試驗動物及場地28
• 2.1.2 試驗試劑28
• 2.1.3 試驗儀器設備28-29
• 2.2 試驗方法29-36
• 2.2.1 實驗設計及處理29
• 2.2.2 樣品采集及處理29-30
• 2.2.3 P4和E2的測定30-31
• 2.2.4 總RNA提取和反轉錄31-33
• 2.2.5 引物設計33-34
• 2.2.6 目的片段RT-PCR擴增和測序34
• 2.2.7 實時熒光定量PCR分析34-35
• 2.2.8 數據分析35-36
• 3 結果與分析36-44
• 3.1 總RNA質量檢測36
• 3.2 等級卵泡TLRs的表達譜36-37
• 3.3 種鵝等級卵泡顆粒層和膜層TLRs家族基因的差異表達37-38
• 3.4 種鵝不同大小卵泡TLRs家族基因的差異表達38-40
• 3.5 LPS對種鵝卵巢卵泡外觀形態(tài)的影響40
• 3.6 LPS對種鵝等級卵泡TLRs的影響40-42
• 3.7 LPS對種鵝P4、E2及其合成關鍵限速酶基因的影響42-44
• 4 討論44-50
• 4.1 種鵝等級卵泡顆粒細胞和膜細胞TLRs家族基因的表達44-45
• 4.2 種鵝不同大小卵泡TLRs家族基因的表達45-46
• 4.3 LPS對卵巢卵泡外觀形態(tài)及TLRs表達的影響46-48
• 4.4 LPS對種鵝P4、E2及其關鍵限速酶基因表達的影響48-50
• 5 結論50-51
• 6 參考文獻51-61
• 7 致謝61-62
• 8 攻讀學位期間發(fā)表論文情況62

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本文編號：835072