發(fā)布時(shí)間：2017-09-10 01:07

  本文關(guān)鍵詞：S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因工程菌的構(gòu)建及活性分析

  更多相關(guān)文章： S-腺苷高半胱氨酸水解酶 構(gòu)建表達(dá)載體 畢赤酵母表達(dá)

【摘要】：S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)在真核細(xì)胞中具有重要的甲基循環(huán)代謝調(diào)節(jié)作用,是存在于生物細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)甲基反應(yīng)的一種水解酶,此水解酶廣泛存在于真核細(xì)胞如:人類、植物、真菌中。SAHH其主要的功能是催化S-腺苷高半胱氨酸(SAH)水解生成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)的可逆反應(yīng)。研究表明人體內(nèi)S-腺苷高半胱氨酸水解酶水平的高低可能影響冠心病和阿爾茨海默癥即老年癡呆病的發(fā)病概率。為了更好的研究該酶,我們通過基因克隆技術(shù)將人源表達(dá)SAHH的基因整合到畢赤酵母菌基因組上,成功構(gòu)建真核表達(dá)體系,再利用畢赤酵母菌表達(dá)該目的蛋白SAHH。具體的實(shí)驗(yàn)方案如下:首先,我們從GenBank中查找到編碼人源的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因,在此目的基因前后設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)和重組標(biāo)簽His-tag。通過全基因合成技術(shù)合成擁有完整編碼框的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因,構(gòu)建pPIC9K-sahh表達(dá)載體。然后,利用同尾酶Bgl II酶切克隆載體,通過電轉(zhuǎn)化使其整合到畢赤酵母菌GS115的基因組中,用遺傳霉素G418篩選出高拷貝轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子通過MD和MM平板鑒定其表型為Mut S型。經(jīng)菌體PCR驗(yàn)證后,將篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子用1%甲醇誘導(dǎo),使其分泌SAHH蛋白,之后我們利用冷凍干燥器將產(chǎn)物濃縮,利用0.22μm的濾膜過濾雜質(zhì)和晶體。最后,我們將濃縮后的液體通過Ni-NTA親和層析對(duì)重組SAHH蛋白進(jìn)行純化。此方法具有篩選方便、蛋白產(chǎn)物分泌表達(dá)穩(wěn)定和易于純化等優(yōu)點(diǎn)。人源sahh基因包含1299個(gè)堿基對(duì),其編碼432個(gè)氨基酸,因此理論上此水解酶的相對(duì)分子量約為47.5 kDa,通過SDS-PAGE得出發(fā)酵產(chǎn)物的條帶大小約為48 kDa。由于SAH被SAHH一步水解為高半胱氨酸和腺苷,而高半胱氨酸可直接用Ellman試劑直接定量測定,在412 nm下吸光度隨著產(chǎn)物的升高而升高,我們測得濃縮后的SAHH蛋白酶活為626.6 IU,而經(jīng)過Ni-NTA親和層析純化后的SAHH蛋白酶活為1106.8 IU。而對(duì)照組即sahh基因沒有整合到畢赤酵母菌GS115基因組上的菌體通過此方法發(fā)酵得到的產(chǎn)物,測其酶活性約為1.33 IU,因此對(duì)于畢赤酵母菌GS115本身的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可以忽略不計(jì)。同時(shí)我們通過查閱文獻(xiàn)獲知有些研究通過對(duì)表達(dá)體系的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化后酶活可達(dá)到1600 IU相比我們所得的酶活較高,但是我相信我們在之后的對(duì)表達(dá)體系的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化后一定比1600 IU高。結(jié)論:此研究中我們成功構(gòu)建畢赤酵母菌真核表達(dá)體系,同時(shí)使得SAHH在畢赤酵母中獲得了高效分泌表達(dá)。我們的研究結(jié)果可與在病原菌中功能相似的甲基化有關(guān)的S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異比較,篩選特異性抑制病原菌SAHN酶活性但不影響SAHH的天然化合物抑制劑。
【關(guān)鍵詞】：S-腺苷高半胱氨酸水解酶 構(gòu)建表達(dá)載體 畢赤酵母表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-14
• 第一章 前言14-24
• 1.1 S-腺苷高半胱氨酸水解酶14-24
• 1.1.1 S-腺苷高半胱氨酸水解酶概論14-15
• 1.1.2 S-腺苷高半胱氨酸水解酶作用底物的生成15-17
• 1.1.2.1 S-腺苷高半胱氨酸再次甲基化途徑16
• 1.1.2.2 S-腺苷高半胱氨酸轉(zhuǎn)硫基途徑16-17
• 1.1.3 S-腺苷高半胱氨酸水解酶的結(jié)構(gòu)17-18
• 1.1.4 SAHH蛋白表達(dá)系統(tǒng)的選擇18-21
• 1.1.4.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)19
• 1.1.4.2 酵母菌表達(dá)系統(tǒng)19-21
• 1.1.5 S-腺苷高半胱氨酸水解酶研究進(jìn)展21-24
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與方法24-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑和培養(yǎng)基的配制26-27
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑的配制26
• 2.3.2 培養(yǎng)基的配制26-27
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法27-40
• 2.4.1 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因sahh的獲得27-28
• 2.4.1.1 人源sahh基因的選擇27-28
• 2.4.1.2 全基因合成基因序列構(gòu)建載體及PCR引物設(shè)計(jì)28
• 2.4.2 目的基因的獲取28-31
• 2.4.2.1 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞的制備28
• 2.4.2.2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞28-29
• 2.4.2.3 陽性克隆菌體的鑒定29-30
• 2.4.2.4 雙酶切反應(yīng)檢驗(yàn)質(zhì)粒30
• 2.4.2.5 線性化質(zhì)粒30-31
• 2.4.2.6 線性化質(zhì)粒的膠回收31
• 2.4.3 畢赤酵母菌GS115表達(dá)載體的構(gòu)建31-34
• 2.4.3.1 畢赤酵母菌GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備32
• 2.4.3.2 畢赤酵母菌GS115電轉(zhuǎn)化32-33
• 2.4.3.3 畢赤酵母GS115轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定33-34
• 2.4.4 畢赤酵母GS115轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶的誘導(dǎo)34-35
• 2.4.4.1 甲醇誘導(dǎo)GS115轉(zhuǎn)化子表達(dá)SAHH34-35
• 2.4.4.2 SAHH蛋白液的濃縮35
• 2.4.5 親和層析35-38
• 2.4.5.1 SAHH蛋白親和層析35-36
• 2.4.5.2 SAHH蛋白洗脫液除鹽36
• 2.4.5.3 SDS-PAGE定量分析SAHH蛋白36-38
• 2.4.6 SAHH蛋白活性測定38-40
• 2.4.6.1 SAHH蛋白活性測定的原理38
• 2.4.6.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線38
• 2.4.6.3 SAHH蛋白活性測定方法38-40
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析40-52
• 3.1 PPIC9K、PPIC9K-SAHH質(zhì)粒的提取40-41
• 3.2 PPIC9K-SAHH雙酶切反應(yīng)驗(yàn)證41-42
• 3.3 PPIC9K-SAHH和PPIC9K質(zhì)粒線性化42-43
• 3.4 線性化質(zhì)粒PPIC9K-SAHH和PPIC9K的膠回收43-44
• 3.5 轉(zhuǎn)化子篩選與驗(yàn)證44-47
• 3.5.1 高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選44-46
• 3.5.2 PCR產(chǎn)物測序46-47
• 3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果47-49
• 3.7 SAHH蛋白活性測定49-52
• 3.7.1 半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制49-50
• 3.7.2 SAHH蛋白活性測定50-52
• 第四章 結(jié)論與展望52-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 致謝60-62
• 附錄62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李曉旭;郭文超;付開峗;李國清;吐爾遜;何江;;腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA對(duì)馬鈴薯甲蟲幼蟲毒力測定[J];新疆農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年01期

2 付志平;楊衛(wèi)平;邱偉華;;S腺苷甲硫氨酸在肝臟疾病中的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J];外科理論與實(shí)踐;2014年02期

3 譚相端;王攀峰;王國平;錢考勝;;高同型半胱氨酸血癥治療藥物研究進(jìn)展[J];世界臨床藥物;2011年11期

4 馮蕾;倪銳志;;高同型半胱氨酸與高血壓相關(guān)性的研究進(jìn)展[J];科技信息;2011年23期

5 姜怡鄧;馬琳娜;劉學(xué)英;王菊;徐支芳;于海嬌;;S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在同型半胱氨酸致平滑肌細(xì)胞增殖中作用機(jī)制的研究[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2011年20期

6 閻峗夢;李慶華;李杰;柴丹丹;薛樂勛;;杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年04期

7 廖素環(huán);施李鳴;溫榮輝;蹇慧;劉芳;黃偉堅(jiān);;S-腺苷高半胱氨酸水解酶在甲基循環(huán)中的代謝調(diào)節(jié)[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年06期

8 杜曉琪;趙博生;;青島文昌魚S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的組織特異性表達(dá)[J];四川動(dòng)物;2011年03期

9 王豪;瞿正萬;朱莉娜;江琪;;阿爾茨海默病血漿總抗氧化狀態(tài)與同型半胱氨酸水平的臨床研究[J];實(shí)用老年醫(yī)學(xué);2011年01期

10 王玨;高秋榮;劉強(qiáng);項(xiàng)林平;王玉芹;王敦;;遲眼蕈蚊抗菌肽BhSGAMP-1-S在大腸桿菌中的優(yōu)化表達(dá)及其活性分析(英文)[J];微生物學(xué)報(bào);2010年09期

，

本文編號(hào)：823825