發(fā)布時間：2017-09-05 17:14

  本文關(guān)鍵詞：黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在里氏木霉中的重組與表達(dá)

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【摘要】：葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,簡稱GOD)能催化β-D-葡萄糖氧化產(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫,具有去葡萄糖、除氧、抑菌、產(chǎn)葡萄糖酸等功效,廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、紡織等各大領(lǐng)域。目前,工業(yè)上主要通過黑曲霉、青霉屬菌株來生產(chǎn)葡萄糖氧化酶。它們產(chǎn)生的GOD主要分布于胞內(nèi)、胞壁之中,純化過程損失大,產(chǎn)率較低。絲狀真菌里氏木霉具有蛋白表達(dá)量大、胞外分泌率高等優(yōu)良特性,利用基因工程技術(shù)在里氏木霉中表達(dá)葡萄糖氧化酶是實(shí)現(xiàn)該酶高效率生產(chǎn)的有效途徑。本文依據(jù)里氏木霉密碼子偏好性對黑曲霉葡萄糖氧化酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將合成的GOD編碼序列嵌入里氏木霉強(qiáng)啟動子(含信號肽)Pcbhl-ss、終止子Tcbhl之間構(gòu)成完整的表達(dá)盒,并與潮霉素B抗性標(biāo)記一同構(gòu)成最終表達(dá)載體pCB-GODo該質(zhì)粒載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至里氏木霉細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),共得到45株陽性轉(zhuǎn)化子。通過雙層平板篩選法對里氏木霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩,確定藍(lán)色圈直徑最大的4株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶復(fù)篩,獲得性能優(yōu)良的重組里氏木霉T.reesei ZU-G3。該菌株72h發(fā)酵液中的GOD酶活高達(dá)100.20U/mL。用SDS-PAGE檢測重組里氏木霉發(fā)酵液可得到約80kDa的葡萄糖氧化酶條帶。將轉(zhuǎn)化子重復(fù)傳代培養(yǎng)10個批次后,提取染色體DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證,可檢測到約1.7kb的葡萄糖氧化酶基因條帶,說明該基因已穩(wěn)定地整合到里氏木霉基因組中。從蛋白質(zhì)及分子層面進(jìn)一步驗(yàn)證了葡萄糖氧化酶已成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)與胞外分泌。通過單因素實(shí)驗(yàn)對里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件逐一進(jìn)行了優(yōu)化。最終得到優(yōu)化后的里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)：乳糖20g,微晶纖維素20g,蛋白胨9g, (NH4)2SO4 2.8g, KH2PO4 4g, MgSO4-7H2O 0.6g, CaCl2 0.6g,微量元素2mL。優(yōu)化后的最適發(fā)酵條件為28℃、pH 5.5。采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基,在最適發(fā)酵條件下?lián)u瓶產(chǎn)酶72h,葡萄糖氧化酶活力最高,達(dá)到154.87U/mL,約是優(yōu)化前GOD活力的1.5倍。研究了重組里氏木霉ZU-G3發(fā)酵所得葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶的最適反應(yīng)溫度、pH分別為40℃、pH5.5。當(dāng)溫度在20～45℃的范圍內(nèi)時,酶的穩(wěn)定性較為理想,水浴保溫1h后仍保留超過85%的酶活力。將酶置于微酸性環(huán)境(pH 5.0～6.5)中保存24h,其酶活仍保留愈80%,穩(wěn)定性較好。金屬離子對酶活性的影響各不相同,Ca3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+離子能不同程度地促進(jìn)葡萄糖氧化酶的活性,Pb2+、Ag+、Fe2+離子則抑制作用明顯。而K+、Na+、 Mg2+離子對GOD酶活基本沒有影響。本課題實(shí)現(xiàn)了黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在里氏木霉中的重組與表達(dá)。相關(guān)研究成果對絲狀真菌基因重組表達(dá)體系的構(gòu)建具有重要意義,為葡萄糖氧化酶的規(guī)�；a(chǎn)及工業(yè)化應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：葡萄糖氧化酶 里氏木霉 基因重組 分泌表達(dá) 發(fā)酵優(yōu)化 酶學(xué)性質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 1 緒論13-24
• 1.1 葡萄糖氧化酶簡介13
• 1.2 葡萄糖氧化酶的來源13-14
• 1.3 葡萄糖氧化酶的反應(yīng)機(jī)制14
• 1.4 葡萄糖氧化酶的分子結(jié)構(gòu)14-15
• 1.5 葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)15
• 1.6 葡萄糖氧化酶的酶活測定方法15-16
• 1.7 葡萄糖氧化酶的應(yīng)用16-21
• 1.7.1 食品飲料添加劑16-19
• 1.7.2 醫(yī)藥行業(yè)19
• 1.7.3 生物技術(shù)領(lǐng)域19-21
• 1.7.4 其他應(yīng)用21
• 1.8 葡萄糖氧化酶的分子生物學(xué)進(jìn)展21-23
• 1.9 本課題研究內(nèi)容23-24
• 2 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在里氏木霉中的表達(dá)24-43
• 2.1 引言24
• 2.2 材料與方法24-35
• 2.2.1 材料與試劑24-25
• 2.2.2 培養(yǎng)基25-26
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器26-27
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)方法27-35
• 2.3 結(jié)果與討論35-41
• 2.3.1 葡萄糖氧化酶基因的密碼子優(yōu)化35-36
• 2.3.2 重組載體的構(gòu)建36-38
• 2.3.3 里氏木霉轉(zhuǎn)化子的篩選38-39
• 2.3.4 里氏木霉轉(zhuǎn)化子的傳代穩(wěn)定性39-40
• 2.3.5 發(fā)酵上清液蛋白電泳檢測40-41
• 2.4 本章小結(jié)41-43
• 3 重組里氏木霉ZU-G3發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶條件的優(yōu)化43-53
• 3.1 引言43
• 3.2 材料與方法43-46
• 3.2.1 材料與試劑43-44
• 3.2.2 培養(yǎng)基44
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器44
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 3.3 結(jié)果與討論46-52
• 3.3.1 碳源對重組T.reesei ZU-G3產(chǎn)葡萄糖氧化酶的影響46-47
• 3.3.2 氮源對重組T.reesei ZU-G3產(chǎn)葡萄糖氧化酶的影響47-48
• 3.3.3 牛肉膏濃度對重組T.reesei ZU-G3產(chǎn)葡萄糖氧化酶的影響48-49
• 3.3.4 發(fā)酵溫度對重組T.reesei ZU-G3產(chǎn)葡萄糖氧化酶的影響49-50
• 3.3.5 發(fā)酵初始pH對重組T.reesei ZU-G3產(chǎn)葡萄糖氧化酶的影響50-51
• 3.3.6 重組T.reesei ZU-G3產(chǎn)葡萄糖氧化酶的時間進(jìn)程51-52
• 3.4 本章小結(jié)52-53
• 4 重組里氏木霉ZU-G3葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究53-63
• 4.1 引言53
• 4.2 材料與方法53-57
• 4.2.1 材料與試劑53
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器53-54
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)方法54-57
• 4.3 結(jié)果與討論57-62
• 4.3.1 葡萄糖氧化酶酶促反應(yīng)的最適溫度57
• 4.3.2 葡萄糖氧化酶的溫度穩(wěn)定性57-58
• 4.3.3 葡萄糖氧化酶酶促反應(yīng)的最適pH58-59
• 4.3.4 葡萄糖氧化酶的pH穩(wěn)定性59-60
• 4.3.5 金屬離子對葡萄糖氧化酶活性的影響60-61
• 4.3.6 葡萄糖氧化酶酶液的貯存穩(wěn)定性61-62
• 4.4 本章小結(jié)62-63
• 5 結(jié)論與展望63-66
• 5.1 結(jié)論63-64
• 5.1.1 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在里氏木霉中的表達(dá)63
• 5.1.2 重組里氏木霉T.reesei ZU-G3發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶條件的優(yōu)化63-64
• 5.1.3 重組里氏木霉T.reesei ZU-G3葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究64
• 5.2 展望64-66
• 參考文獻(xiàn)66-74
• 附錄：論文發(fā)表情況74

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1 陳士華;薛珍;姚金杰;吳興泉;;里氏木霉纖維二糖水解酶Ⅱ的生物信息學(xué)研究[J];河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年04期

2 葛春梅;徐娟娟;孫芹英;張潔;蔡敬民;潘仁瑞;;里氏木霉和雞腿菇利用秸稈共發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)降解酶[J];生物工程學(xué)報(bào);2009年12期

3 安莉穎;施思;秦麗娜;陳飛;董志揚(yáng);伍紅;;里氏木霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其同源轉(zhuǎn)化研究[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年03期

4 田明;郭宏文;陳連峰;Q，

本文編號：799233