本文關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒ORF3基因的變異分析及其熒光定量RT-PCR檢測方法的研究

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【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一種仔豬急性腸道傳染病,該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,成為當(dāng)前共同關(guān)注的豬病問題。適時掌握PEDV流行毒株的分子特征并進(jìn)行快速診斷防控對該病具有重要意義。本研究開展了PEDV ORF3基因的克隆與變異分析,再以此為基礎(chǔ)建立了可快速檢測PEDV的Eva Green熒光定量RT-PCR方法,為PED的診斷提供新的技術(shù)支持。1 PEDVORF3基因的變異分析根據(jù)GenBank中PEDV CV777株ORF3基因序列,設(shè)計特異性引物,用RT-PCR擴增了2014-2015年四川、重慶、福建、黑龍江等地共21個代表性的ORF3基因,并構(gòu)建重組質(zhì)粒,進(jìn)行了基因測序和變異分析。結(jié)果顯示,21個ORF3基因全長675 bp,編碼224個氨基酸。ORF3基因沒有堿基缺失,只有堿基突變,而且多以C→T、T→C、G→A、A→T等突變形式存在,氨基酸突變多以Val→Ala、Phe→Val、Ala→Thr、Asn→Ser等突變形式存在。21個ORF3序列的核苷酸和氨基酸序列相似性為分別98.1%～100%和96.4%～100%；而與CV777標(biāo)準(zhǔn)株相比,核酸序列相似性在95.9%～99.6%,氨基酸序列相似性在94.2%～99.6%。經(jīng)過遺傳進(jìn)化分析,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹后21個ORF3序列和參考序列可分成三個組,即G1、G2和G3。我國的21個PEDV屬于G3組,與韓國株(2008-2012)、美國株(2014)、德國株(2014)以及部分前期中國株(2012-2014)位于同一分支,但與G1群的英國株(Brl/87)和標(biāo)準(zhǔn)株(CV777)等、G2群的DR13弱毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。2 Eva Green熒光定量RT-PCR檢測PEDV方法的研究根據(jù)GenBank中PEDV CV777株及Attenuated DR13株ORF3基因序列,設(shè)計一對特異性引物,以野毒和疫苗毒的cDNA為模板,采用RT-PCR擴增并構(gòu)建了2個重組質(zhì)粒,經(jīng)核酸蛋白儀測定OD_(280)和OD_(260)值后,計算得到的拷貝數(shù)分別是4.79×10~(11)copies/μL和5.17×10~(11)copies/μL。在優(yōu)化條件(引物濃度和退火溫度)后,野毒和疫苗質(zhì)粒濃度分別為4.79×10~3copies/μL～4.79×10~8 copies/μL和5.17×10~3 copies/μL～5.17×10~8 copies/μL時,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線,構(gòu)建Eva Green熒光定量RT-PCR檢測方法(Eva Green real time quantitative PCR,簡稱EG-qRT-PCR)。通過檢測PEDV、TGEV、JEV、PoRV、PRRSV、 PCV、PRV和PPV,只有PEDV有擴增峰,證明特異性良好；EG-qRT-PCR及RT-PCR可檢測的最低濃度分別為100 copies/μL、10~3 copies/μL;強(弱)毒的組內(nèi)和組間重復(fù)試驗顯示,變異系數(shù)都小于0.56%(0.82%)和1.05%(1.02%),重復(fù)性良好。用該方法檢測了2014-2016四川地區(qū)共130份仔豬腹瀉病料,EG-qRT-PCR和RT-PCR陽性檢出率分別為72.31%(94/130)、58.46%(76/130)，，陽性樣品的PEDV濃度為5.13×105 copies/μL～6.31×10~(10) copies/μL。用該方法初步測定了我國市售PEDV疫苗含量,結(jié)果顯示弱毒活疫苗PEDV含量可以達(dá)到2.49×10~8 copies/μL,但是滅活疫苗中PEDV檢出含量較低,最高只有5.80×10~2 copies/μL。以EG-qRT-PCR測定了臨床發(fā)病豬的心、肝、脾、肺、腎、腸淋巴結(jié)和腸組織的PEDV含量后,病毒檢出濃度分別為3.09×10~5～4.47×10~8 copies/μL,8.91×10~4～1.38×10~8 copies/μL,0～6.61×10~5 copies/μL,0～3.16×10~6 copies/μL,4.79×10~5～6.31×10~8 copies/μL,1.12×10~7～9.12×10~9 copies/μL,3.55×10~9～3.16×10~(12) copies/μL,其中腸組織PEDV含量最多,其次為腸淋巴結(jié)；在這些組織中脾肺組織的檢出率最低,偶爾可以檢測到。
【關(guān)鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 ORF3基因 變異分析 Eva Green熒光定量RT-PCR
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文縮略詞表8-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述13-25
• 1 PEDV概述13-19
• 1.1 PEDV的形態(tài)結(jié)構(gòu)13
• 1.2 PEDV基因組結(jié)構(gòu)特點13-17
• 1.2.1 復(fù)制酶多聚酶基因14-15
• 1.2.2 結(jié)構(gòu)基因15-16
• 1.2.3 ORF3基因16-17
• 1.3 PEDV病原學(xué)特性17
• 1.4 PEDV致病機理17-18
• 1.5 PEDV臨床癥狀18
• 1.6 PEDV病理變化18
• 1.7 PEDV流行情況18-19
• 2 PEDV診斷方法研究進(jìn)展19-24
• 2.1 病原學(xué)檢測19
• 2.1.1 分離鑒定19
• 2.2 免疫學(xué)方法19-21
• 2.2.1 免疫電鏡法19-20
• 2.2.2 免疫熒光法20
• 2.2.3 血清中和試驗20
• 2.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗20-21
• 2.2.5 免疫膠體金技術(shù)21
• 2.3 分子生物學(xué)技術(shù)21-24
• 2.3.1 核酸探針雜交技術(shù)21
• 2.3.2 RT-PCR法21-22
• 2.3.3 逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)22
• 2.3.4 原位PCR法22
• 2.3.5 巢式PCR22-23
• 2.3.6 限制性片段長度多態(tài)性分析23
• 2.3.7 實時熒光定量RT-PCR23-24
• 3 本研究的目的與意義24-25
• 第二部分 研究內(nèi)容25-61
• 第一章 PEDV ORF3基因的變異分析25-40
• 1 材料25
• 1.1 菌株、質(zhì)粒25
• 1.2 主要試劑25
• 1.3 主要儀器25
• 2 方法25-30
• 2.1 引物設(shè)計25-26
• 2.2 PEDV ORF3基因的克隆26-30
• 2.2.1 PEDV RNA的提取26
• 2.2.2 PEDV PCR26-27
• 2.2.3 PEDV ORF3基因的克隆27-30
• 2.2.4 PEDV ORF3基因遺傳進(jìn)化分析30
• 3 結(jié)果30-38
• 3.1 RT-PCR鑒定結(jié)果30-31
• 3.2 PEDV ORF3基因序列分析31-34
• 3.3 PEDV ORF3基因遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建34-38
• 4 討論38-39
• 4.1 關(guān)于PEDV的流行情況38
• 4.2 PEDV ORF3基因的變異分析38-39
• 5 小結(jié)39-40
• 第二章 Eva Green熒光定量RT-PCR檢測PEDV方法的建立40-61
• 1 材料40
• 1.1 菌株、質(zhì)粒40
• 1.2 主要試劑40
• 1.3 主要儀器設(shè)備40
• 2 方法40-44
• 2.1 引物設(shè)計40-41
• 2.2 Eva Green熒光定量檢測PEDV方法的建立41-44
• 2.2.1 PEDV ORF3基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備41-42
• 2.2.2 EG-qRT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化42
• 2.2.3 EG-qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線的建立42
• 2.2.4 EG-qRT-PCR特異性試驗42
• 2.2.5 EG-qRT-PCR重復(fù)性試驗42
• 2.2.6 EG-qRT-PCR靈敏度試驗42-43
• 2.2.7 EG-qRT-PCR的臨床應(yīng)用43-44
• 3 結(jié)果44-57
• 3.1 PEDV ORF3基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建44-45
• 3.2 EG-qRT-PCR退火溫度及引物濃度優(yōu)化結(jié)果45-46
• 3.3 EG-qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線的制作46-48
• 3.4 EG-qRT-PCR特異性試驗結(jié)果48-49
• 3.5 EG-qRT-PCR重復(fù)性實驗結(jié)果49-51
• 3.6 EG-qRT-PCR敏感性試驗結(jié)果51-52
• 3.7 EG-qRT-PCR臨床病料檢測結(jié)果52-54
• 3.8 PEDV商品疫苗病毒含量的檢測54
• 3.9 PEDV不同組織病毒含量檢測54-57
• 4 討論57-60
• 5 小結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-73
• 致謝73-74
• 附錄74-77
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄77

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：738815