本文關(guān)鍵詞：C3AR1基因促進(jìn)HL60細(xì)胞遷移侵襲及耐藥機(jī)制研究

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【摘要】：第一部分HL60-C3AR1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株鑒定目的:驗(yàn)證前期試驗(yàn)中構(gòu)建的HL60-C3AR1,為研究該基因在HL60細(xì)胞株中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。方法:1.利用流式細(xì)胞儀檢測HL60-C3AR1、HL60-Venus及親本株HL60 GFP表達(dá)水平;2.提取HL60-C3AR1、HL60-Venus及親本株HL60總RNA,逆轉(zhuǎn)為c DNA,通過定量PCR方法,利用SYBR Green染料特異擴(kuò)增C3AR1基因片段,進(jìn)行定量分析。3.提取HL60-C3AR1、HL60-Venus及親本株HL60膜蛋白,western方法檢測兩株細(xì)胞C3AR1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:綠色熒光蛋白GFP在HL60-C3AR1及HL60-Venus表達(dá)水平都大于98%;經(jīng)定量PCR檢測,HL60-C3AR1細(xì)胞C3AR1基因m RNA表達(dá)水平較HL60-Venus及親本株HL60細(xì)胞顯著升高;Western結(jié)果顯示,C3AR1基因蛋白水平在HL60-C3AR1細(xì)胞顯著高于HL60-Venus及親本株HL60。結(jié)論:C3AR1基因在HL60-C3AR1細(xì)胞株穩(wěn)定高表達(dá),為研究C3a R1基因在HL60細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。第二部分高表達(dá)C3AR1基因促進(jìn)HL60細(xì)胞發(fā)生遷移及侵襲目的:探討C3AR1對人早幼粒白血病細(xì)胞株(Human promyelocytic leukemia cells,HL60)遷移及侵襲的作用和機(jī)制。方法:1.在加入或不加C3a和SDF-1條件下,利用transwell小室對HL60-C3AR1及HL60-Venus細(xì)胞進(jìn)行遷移及侵襲實(shí)驗(yàn);2.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CXCR4蛋白的表達(dá)水平,確定是否與CXCR4蛋白表達(dá)變化有關(guān)系;3.利用PCR ARRAY,篩選上調(diào)和下調(diào)的基因,進(jìn)一步探討其可能的發(fā)生機(jī)制。結(jié)果:高表達(dá)C3AR1的HL60細(xì)胞,在C3a和SDF-1的作用下,細(xì)胞遷移及侵襲能力較轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞明顯增多。PCR ARRAY發(fā)現(xiàn)了包括CCL2在內(nèi)的16個基因顯著上調(diào),4個基因顯著性下調(diào),但與CXCR4的表達(dá)無關(guān)。結(jié)論:C3a和SDF-1促進(jìn)高表達(dá)C3AR1細(xì)胞遷移和侵襲是通過調(diào)控CCL2等遷移相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)的。第三部分探討C3AR1基因促進(jìn)HL60細(xì)胞對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ毒劑依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌耐藥性及其機(jī)制目的:探討C3AR1基因促進(jìn)HL60細(xì)胞對依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌耐藥性及其可能的機(jī)制。方法:1.用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三種化療藥以不用濃度分別作用HL60-C3AR1、HL60-Venus細(xì)胞24h、48h、72h,CCK8法檢測細(xì)胞存活率。觀察C3AR1對HL60對上述三種化療藥藥物敏感性的影響。2.用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三種化療藥以不用濃度分別作用HL60-C3AR1、HL60-Venus細(xì)胞24h,Annexin V-PE/7-AAD法檢測細(xì)胞凋亡水平;3.用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三種化療藥以適當(dāng)濃度分別作用HL60-C3AR1、HL60-Venus細(xì)胞24h,48h,Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞核形態(tài)變化;4.分別用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌以適當(dāng)濃度處理細(xì)胞24h后,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)為c DNA,進(jìn)行凋亡PCR ARRAY檢測,找出上調(diào)及下調(diào)基因探究其可能發(fā)生的機(jī)制;5.Western Blot檢測共同下調(diào)及共同上調(diào)的基因,進(jìn)一步驗(yàn)證其可能的機(jī)制;結(jié)果:加藥實(shí)驗(yàn)顯示HL60-C3AR1對依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三種化療藥表現(xiàn)出明顯耐藥性;凋亡實(shí)驗(yàn)顯示,加不同濃度依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌分別處理24h,HL60-C3AR1凋亡水平較HL60-Venus顯著降低;Hoechst 33342染色顯示加適當(dāng)濃度依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌分別處理24h、48h顯示HL60-C3AR1細(xì)胞核碎裂情況較HL60-Venus細(xì)胞顯著降低;凋亡PCR ARRAY篩選出不同上調(diào)與下調(diào)基因,其中有BIRC7、SOCS2、LCK三個共同下調(diào)基因;western檢測HL60-C3AR1細(xì)胞BIRC7、SOCS2、LCK表達(dá)水平較HL60-Venus細(xì)胞明顯降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),C3AR1高表達(dá)的HL60-C3AR1細(xì)胞株加藥處理后,線粒體凋亡途徑蛋白發(fā)生了改變,抗凋亡蛋白BCL-XL,BCL2表達(dá)水平上調(diào),而促凋亡蛋白Bax,Bad表達(dá)水平下調(diào)結(jié)論:C3AR1通過調(diào)控BIRC7、LCK、SOCS2等基因進(jìn)一步通過線粒體途徑介導(dǎo)了HL60對TOPOⅡ毒劑VP16、阿霉素、米托蒽醌產(chǎn)生耐藥。
【關(guān)鍵詞】：C3AR1 HL-60 RT-PCR C3AR1 HL-60 遷移 侵襲 C3AR1 HL-60 耐藥 依托泊苷 多柔比星 米托蒽醌
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 引言10-12
• 第一部分 HL60-C3AR1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株鑒定12-23
• 材料與方法12-18
• 結(jié)果18-20
• 討論20-21
• 參考文獻(xiàn)21-23
• 第二部分 C3AR1基因促進(jìn)HL60細(xì)胞發(fā)生遷移及侵襲23-33
• 材料與方法23-27
• 結(jié)果27-30
• 討論30-31
• 參考文獻(xiàn)31-33
• 第三部分 探討C3AR1基因促進(jìn)HL60細(xì)胞對依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌耐藥性及其機(jī)制33-46
• 材料與方法33-36
• 結(jié)果36-41
• 討論41-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 結(jié)論46-48
• 綜述48-55
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 英文縮略詞表55-56
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文56-57
• 致謝57-58

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本文編號：722323