本文關鍵詞：VIGS技術高通量篩選棉花抗黃萎病相關基因

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【摘要】：棉花黃萎病是由黃萎病菌引起的一種土傳真菌維管束病害，嚴重危害棉花的生產(chǎn)，被稱為“棉花的癌癥”。棉花黃萎病危害嚴重，難以防控，很大程度上歸咎于抗黃萎病抗源的缺乏，及對棉花抗黃萎病分子機理研究的欠缺，再加上生產(chǎn)上缺少行之有效的防控技術和措施。從基因水平上揭示棉花抗黃萎病的特征和機制，依然是揭示棉花抗黃萎病分子機理，提高棉花對黃萎病抗性的基礎工作。然而長期以來，因受到研究材料的限制，以及研究手段的欠缺，從基因水平上去研究和探索棉花抗黃萎病分子機理難度很大。病毒介導的基因沉默技術（virus induced gene silencing，VIGS）是利用反向遺傳學策略揭示植物基因功能的重要技術之一，，為從基因水平上揭示棉花抗黃萎病的分子機制提供了新的契機。 本研究以中國農業(yè)科學院植物保護研究所棉花病害組選育的陸地棉(Gossypiumhirsutum)抗黃萎病品系——中植棉KV3為材料，在實驗室前期抑制差減雜交和基因芯片分析的基礎上，初步挑選出106個可能與棉花抗黃萎病相關的基因，并用病毒介導的基因沉默技術（virus induced gene silencing，VIGS）研究這些基因在棉花抗黃萎病中的作用和功能。所利用的VIGS載體為棉葉皺縮病毒（Cotton leaf crumple virus,CLCrV）改造�？偣渤晒嫿�6大類，62個VIGS基因載體。所構建的載體導入農桿菌后，用農桿菌侵染法進行基因沉默實驗，靶向性沉默相對應的基因，然后用傷根法接種黃萎病菌，檢測基因沉默棉花植株對棉花黃萎病抗性的變化情況。由此，利用VIGS這一反向遺傳學的技術高通量地篩選出棉花抗黃萎病相關基因，為棉花抗黃萎病機制的研究，以及棉花抗病品種分子選育提供基礎性工作。主要研究結果如下： 1.利用CLCrV誘導的基因沉默體系，靶向性沉默葉綠素合成相關基因CHLI和CLA1，基因沉默后植株的葉片表現(xiàn)出明顯的黃化和白化表型；還確認了目的基因沉默植株中，目的基因的表達量也明顯降低；且空載體轉化對照植株與野生型植株對黃萎病菌的抗性無明顯差異；說明該體系在中植棉KV3中可沉默目的基因，用于目的基因功能的研究； 2.運用VIGS技術高通量篩選棉花抗黃萎病相關基因，三輪重復試驗篩選出8個與棉花抗、感黃萎病相關的基因。其中6個基因[Gh39（bZIP）、Gh24（GRAS）、Gh58（WRKY）、Gh55（EIN2）、Gh114（XTH）、Gh97（Drigent-like protein）]正調控棉花對黃萎病的抗性，2個基因[Gh15（bZIP）、Gh31（NAC5）]負調控棉花對黃萎病的抗性； 3.對其中的3個基因進行功能注釋與表達特性分析。結果顯示：Gh55為乙烯信號途徑中的正向調控因子EIN2，利用VIGS技術沉默該基因，沉默植株接種黃萎病菌后，病癥明顯加重，說明該基因是一棉花黃萎病的正調控基因；沉默Gh97（Dirigent-like protein）的植株接種黃萎病菌后，癥狀顯著加重，聚類分析結果顯示該基因屬于DIRb/d家族，且在根部的表達量很高，這些結果說明，Gh97可能在根部介導細胞發(fā)生木質化，從而阻止了黃萎病菌的入侵及繁殖，提高了棉花對黃萎病菌的抗性；Gh114是一種木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶(XTH)，沉默該基因的植株對黃萎病菌更敏感，表明該基因可能通過改變植物細胞壁的結構，參與棉花對黃萎病菌的抗性。
【關鍵詞】：棉花黃萎病 VIGS 高通量篩選 抗性相關基因
【學位授予單位】：山西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S562
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 英文縮略表9-13
• 1 緒論13-25
• 1.1 棉花黃萎病13-20
• 1.1.1 棉花黃萎病的危害13
• 1.1.2 棉花黃萎病菌的生物學特性13-14
• 1.1.3 棉花黃萎病菌的侵染過程及致病機理14-16
• 1.1.4 棉花的抗病機理16-20
• 1.2 病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silence）20-22
• 1.2.1 VIGS 的機制20-21
• 1.2.2 VIGS 技術的建立、發(fā)展及運用21-22
• 1.2.3 VIGS 技術的優(yōu)點及局限性22
• 1.3 本研究的目的與意義22-25
• 2 材料與方法25-37
• 2.1 材料與儀器25-26
• 2.1.1 材料25
• 2.1.2 試劑與儀器25-26
• 2.2 實驗方法26-37
• 2.2.1 棉花材料的培養(yǎng)26
• 2.2.2 病原菌培養(yǎng)及接種方法26
• 2.2.3 VIGS 載體的構建26-33
• 2.2.4 農桿菌浸染的 VIGS 接種方法33
• 2.2.5 熒光定量 PCR 檢測目的基因表達量33-35
• 2.2.6 沉默植株抗病性檢測35-36
• 2.2.7 組織特異性檢測36-37
• 3 結果與分析37-55
• 3.1 基因的挑選37
• 3.2 VIGS 載體的構建37-41
• 3.2.1 構建 VIGS 載體37-39
• 3.2.2 成功構建的 VIGS 載體39-41
• 3.3 陽性對照基因驗證 VIGS 沉默體系41-42
• 3.4 qPCR 檢測目的基因的沉默效率42-43
• 3.5 利用 VIGS 技術高通量篩選棉花抗黃萎病相關基因43-44
• 3.6 接菌后表型及癥狀44-47
• 3.7 部分抗病相關基因功能注釋及表達特征分析47-55
• 3.7.1 乙烯相關基因47-50
• 3.7.2 抗病相關基因50-52
• 3.7.3 細胞壁重構相關基因52-55
• 4 討論55-57
• 5 結論57-59
• 致謝59-61
• 參考文獻61-71
• 附錄 A71-74
• 附件 B74-81
• 附錄 C：攻讀碩士期間發(fā)表的論文81

【參考文獻】

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本文編號：711989