本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)植酸酶和內(nèi)切葡聚糖酶基因乳酸桿菌的構(gòu)建及其肉雞飼喂效果驗(yàn)證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《西北農(nóng)林科技大學(xué)》 2014年

轉(zhuǎn)植酸酶和內(nèi)切葡聚糖酶基因乳酸桿菌的構(gòu)建及其肉雞飼喂效果驗(yàn)證

王磊  

【摘要】：β-葡聚糖和植酸（鹽）是單胃動(dòng)物日糧中主要的兩種抗?fàn)I養(yǎng)因子，對蛋白質(zhì)、脂類、礦物質(zhì)離子等營養(yǎng)素均具有極強(qiáng)的吸附和螯合能力，同時(shí)單胃動(dòng)物（如豬和家禽）胃腸道缺乏或很少分泌β-葡聚糖和植酸降解酶，導(dǎo)致一些營養(yǎng)素的消化和吸收率降低，大量營養(yǎng)素被排泄到體外，造成對環(huán)境的污染。在實(shí)際生產(chǎn)中，通過添加外源性飼料酶制劑可在一定程度上消除這兩種抗?fàn)I養(yǎng)因子的不良影響，但也增加了飼料成本，且只能取得短期的效應(yīng)，同時(shí)在飼料制粒過程中，酶制劑易因高溫而失活；因此運(yùn)用基因工程技術(shù)，構(gòu)建能夠表達(dá)和分泌水解酶類的乳酸桿菌重組菌，將是一種可替代的和廉價(jià)的策略。本研究的目的在于從自然界中篩選具有高植酸酶活性或內(nèi)切葡聚糖酶活性的菌株，并克隆其對應(yīng)的植酸酶基因和內(nèi)切葡聚糖酶基因，同時(shí)從肉雞腸道內(nèi)篩選和鑒定優(yōu)勢益生乳酸桿菌作為宿主菌，通過基因工程技術(shù)將兩個(gè)酶基因同時(shí)克隆到乳酸桿菌中，構(gòu)建既具有益生特性又具有植酸酶活性和內(nèi)切葡聚糖酶活性的多功能轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌，以低有效磷水平的大麥-小麥型日糧為基礎(chǔ)日糧，驗(yàn)證其肉雞飼喂效果，以此來改善肉雞營養(yǎng)素利用率、提高肉雞生產(chǎn)性能、降低肉雞腸道疾病發(fā)生率、節(jié)約飼養(yǎng)成本，并為多功能轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。主要研究結(jié)果如下： 1.從自然界中分別篩選出1株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的細(xì)菌和1株產(chǎn)植酸酶的真菌，經(jīng)菌落形態(tài)、染色觀察及16S和18S保守序列測序鑒定，WL001為枯草芽孢桿菌，WL002為煙曲霉。Bacillus. subtilis WL001發(fā)酵產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的最佳碳源為麩皮，氮源為蛋白胨，初始pH為6-7，培養(yǎng)時(shí)間為24h；Aspergillus. fumigatus WL002發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的最佳碳源為麩皮，氮源為蛋白胨，初始pH為5-6，培養(yǎng)時(shí)間為24h。B. subtilis WL001內(nèi)切葡聚糖酶和A. fumigatus WL002植酸酶反應(yīng)的最適溫度均為60℃，最適pH分別為5.5和5.5-6.5。 2.從B. subtilis WL001基因組DNA中成功克隆內(nèi)切葡聚糖酶基因，大小1500bp，命名為celW，，獲得Genbank登錄號(hào)（No. KJ528404）；內(nèi)切葡聚糖酶基因在Ecoil BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，蛋白分子量為55kD，胞內(nèi)上清內(nèi)切葡聚糖酶活性為1.18U/ml。從A. fumigatus WL002基因組DNA中成功克隆植酸酶基因成熟肽，大小1320bp，命名為phyAW，獲得Genbank登錄號(hào)（No. KJ528403）；植酸酶基因成熟肽在EcoilTransetta (DE3)中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，蛋白分子量為48.2kD，胞內(nèi)上清植酸酶活性為0.64U/ml。 3.乳酸桿菌在肉雞嗉囊中密度最大、分布最廣，在盲腸中密度最小、分布最少，大多集中分布在肉雞腸道前端。L. reuteri、L. johnsonii、L. acidophilus、L. crispatus、L.salivarius和L. aviarius是貫穿于整個(gè)肉雞腸道的優(yōu)勢乳酸桿菌。L. reuteri是肉雞腸道最豐富的乳酸桿菌。L. reuteri XC1具有良好的益生特性，是理想或潛在的基因工程宿主菌。 4.成功構(gòu)建了內(nèi)切葡聚糖酶基因乳酸桿菌表達(dá)質(zhì)粒、植酸酶基因乳酸桿菌表達(dá)質(zhì)粒及其共表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為pLEM4157(cel)、pLEM4158(phy)、pLEM4159-cel/phy。通過電轉(zhuǎn)化和平板篩選，獲得相應(yīng)的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性（0.96±0.08U/mL）的轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌L. reuteri pLEM4157(cel)、具有植酸酶活性（0.51±0.13U/mL）的轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌L. reuteri pLEM4158(phy)，及同時(shí)具有內(nèi)切葡聚糖酶和植酸酶活性（內(nèi)切葡聚糖酶活性0.68±0.17U/mL；植酸酶活性0.42±0.05U/mL）羅伊乳酸桿菌L. reuteripLEM4159-cel/phy。轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌獲得與野生型羅伊乳酸桿菌相似的酸和膽鹽耐受特性，當(dāng)pH為2.0和3.0時(shí)，其成活率分別是13%和21%左右，當(dāng)膽鹽濃度為0.3%和0.5%時(shí)，其成活率分別是10%和0.3%左右。 5. L. reuteri pLEM4158(phy)和L. reuteri pLEM4159-cel/phy可改善21–42日齡肉仔雞飼料轉(zhuǎn)化率；L. reuteri pLEM4157(cel)、L. reuteri pLEM4158(phy)和L. reuteripLEM4159-cel/phy可改善整個(gè)飼養(yǎng)期（1-42d）肉仔雞飼料轉(zhuǎn)化率，但對肉仔雞日增重和日采食量無顯著影響。 6. L. reuteri pLEM4159-cel/phy可提高21日齡肉仔雞脛骨灰分、鈣和磷水平；L.reuteri pLEM4157(cel)可提高21日齡肉仔雞脛骨鈣水平；羅伊乳酸桿菌組21日齡肉仔雞脛骨磷含量呈現(xiàn)增加的趨勢，對21日齡肉仔雞脛骨鈣的沉積有輕微的促進(jìn)作用；L.reuteri pLEM4158(phy)可提高42日齡肉仔雞脛骨磷水平。 7.飲水飼喂轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌能降低肉仔雞21日齡和42日齡十二指腸、空腸pH，對肉仔雞屠宰性能無顯著影響，僅可輕微降低腹脂率，可顯著降低胸肌滴水損失、蒸煮損失和剪切力，提高肌肉的嫩度。 8. L. reuteri pLEM4159-cel/phy可顯著提高21日齡和42日齡肉仔雞十二指腸絨毛高度；L. reuteri pLEM4158(phy)、L. reuteri pLEM4159-cel/phy和L. reuteri pLEM4157(cel)可顯著降低21日齡肉仔雞十二指腸和空腸隱窩深度，增加21日齡肉仔雞空腸腸壁厚度，降低42日齡肉仔雞回腸隱窩深度，增加42日齡肉仔雞十二指腸絨毛高度；L. reuteri pLEM4158(phy)和L. reuteri pLEM4159-cel/phy可顯著提高42日齡肉仔雞回腸絨毛高度和絨毛寬度。 9. L. reuteri pLEM4159-cel/phy可顯著降低21日齡肉仔雞盲腸大腸桿菌的數(shù)量；L.reuteri pLEM4157(cel)可顯著降低肉仔雞盲腸韋榮球菌的數(shù)量；飼喂轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌，21日齡肉仔雞盲腸大腸桿菌、韋榮球菌和擬桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)降低的趨勢，雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)增加的趨勢，42日齡肉仔雞盲腸乳酸桿菌和糞腸球菌的數(shù)量呈現(xiàn)增加趨勢。 綜上所述：本研究獲得1株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的B. subtilis WL001和1株產(chǎn)植酸酶的A. fumigatus WL002；成功克隆目的基因，并實(shí)現(xiàn)大腸桿菌可溶性表達(dá)。L. reuteri是雞腸道最豐富的乳酸桿菌。L. reuteri XC1具是理想或潛在的基因工程宿主菌。獲得具有益生特性、內(nèi)切葡聚糖酶和植酸酶活性的多功能轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌。重組的羅伊乳酸桿菌對肉仔雞飼料轉(zhuǎn)化率、脛骨特性、腸道pH、小腸組織形態(tài)和盲腸微生物菌群有一定的改善作用。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：S831.5
【目錄】：

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  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)植酸酶和內(nèi)切葡聚糖酶基因乳酸桿菌的構(gòu)建及其肉雞飼喂效果驗(yàn)證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：67195