本文關(guān)鍵詞：肺臟特異性表達Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小型豬的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學》 2014年

肺臟特異性表達Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小型豬的建立

雒偉偉  

【摘要】：利用Cre/loxP系統(tǒng)制備條件性基因敲除小鼠動物模型是活體內(nèi)研究基因功能的有效策略。然而，在某些方面，小鼠、大鼠等嚙齒類動物并不適合于人類疾病模型。豬作為哺乳動物，在基因組水平、器官結(jié)構(gòu)大小、生理特征等方面都與人類更接近。因此，人類疾病的豬動物模型能夠更好地反應(yīng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程和病理特征。在本實驗中，利用豬體細胞核移植技術(shù)（somatic cell nuclear transfer,SCNT）構(gòu)建組織特異性表達Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小型豬，為進行組織特異性基因敲除小型豬動物模型構(gòu)建提供Cre重組酶表達工具豬。 為了獲得腎臟特異性表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小型豬，我們選擇豬源AQP2基因啟動子區(qū)序列來驅(qū)動Cre重組酶表達。AQP2(Aquaporin2)屬于水通道蛋白家族，主要表達于哺乳動物腎臟集合管細胞�；谛⌒拓i體內(nèi)AQP2表達分析結(jié)果與AQP2基因啟動子區(qū)序列多重比對分析結(jié)果，選擇豬源AQP2轉(zhuǎn)錄起始位點上游3,090bp序列來驅(qū)動Cre重組酶表達。構(gòu)建的Cre表達載體命名為AQP2-Cre，全長11,045bp。載體瞬時轉(zhuǎn)染五種細胞系：PK15、Hela、A549、HepG-2、LLC-PK1，并分析Cre重組酶表達情況。檢測結(jié)果表明，AQP2-Cre在LLC-PK1細胞中表達，其它細胞系中不表達。 AQP2-Cre載體線性化后，轉(zhuǎn)染中國實驗小型豬胎兒成纖維細胞。利用含G418(450μg/ml)的選擇性DMEM培養(yǎng)基篩選14天左右，獲得具有neo抗性的細胞克隆。提取細胞克隆基因組DNA，利用跨Cre表達序列與AQP2基因啟動子區(qū)序列的跨區(qū)檢測引物進行PCR鑒定，并測序鑒定。選取三株細胞狀態(tài)良好的陽性AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因細胞克隆作為核供體細胞，共制備1427枚重構(gòu)胚，分別輸入到5頭待孕母豬輸卵管。結(jié)果，3頭受孕母豬順利分娩，共獲得12頭克隆小型豬（均來自同一細胞克�。�。利用AQP2-Cre跨區(qū)檢測引物鑒定新生克隆小型豬，結(jié)果表明12頭全部為陽性。測序結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小型豬基因組整合了完整的Cre表達序列。 利用RT-PCR與western blotting分析轉(zhuǎn)基因小型豬Cre表達情況。檢測結(jié)果顯示，Cre重組酶表達于AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬肺臟組織，其它組織中不表達。免疫組化分析結(jié)果表明，Cre重組酶表達于肺泡上皮細胞，且細胞質(zhì)與細胞核均有表達。 利用反向PCR (Inverse PCR)分析外源基因在AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬基因組上的整合位點，利用絕對定量PCR (Absolutly qRT-PCR)分析各轉(zhuǎn)基因小型豬基因組的Cre拷貝數(shù)。共檢測到4個AQP2-Cre整合位點，Cre拷貝數(shù)為8-12。不同轉(zhuǎn)基因小型豬，或同一轉(zhuǎn)基因小型豬各組織基因組樣本中，Cre拷貝數(shù)差異均不明顯（P0.5）。隨后，檢測了5頭不同月齡(新生、1月齡、5月齡、10月齡、15月齡)轉(zhuǎn)基因小型豬肺組織基因組中AQP2-Cre整合情況，并利用相對定量PCR (Relative qRT-PCR)分析了Cre重組酶的表達變化。分析結(jié)果表明，不同月齡AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬，Cre拷貝數(shù)無明顯變化(P0.5)，且Cre重組酶能夠穩(wěn)定表達(P0.5)。 為進一步分析Cre重組酶在傳代過程中的表達變化，我們選擇5月齡轉(zhuǎn)基因小型豬與正常非轉(zhuǎn)基因小型豬雜交，獲得3頭為陽性AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬。分析結(jié)果表明F1代陽性轉(zhuǎn)基因小型豬同樣為肺泡上皮細胞特異性表達Cre重組酶。AQP2-Cre整合情況分析結(jié)果表明，F(xiàn)1代轉(zhuǎn)基因小型豬基因組樣本中Cre拷貝數(shù)為5-6。相比較于F0代轉(zhuǎn)基因小型豬，Cre拷貝數(shù)明顯減少(P0.05)，且其中一頭轉(zhuǎn)基因小型豬基因組中只檢測到3個整合位點。利用相對定量PCR方法分析轉(zhuǎn)基因小型豬傳代過程中Cre重組酶表達水平變化。結(jié)果顯示，，傳代后Cre重組酶表達量無明顯變化(P0.05)。 在本實驗中，雖然沒有明確導致AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因豬肺臟特異性表達Cre重組酶的原因。但分析結(jié)果表明，本實驗所制備AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬能夠穩(wěn)定表達Cre重組酶。結(jié)合實驗室之前進行的Cre重組酶活性研究結(jié)果，認為該AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬能夠應(yīng)用于肺臟特異性基因敲除豬模型的構(gòu)建。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q789
【目錄】：

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