本文關(guān)鍵詞：cPLA2α基因敲除小鼠的構(gòu)建、繁殖與鑒定

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【摘要】：目的:c PLA2α能夠高選擇性地水解膜磷脂,起始花生四烯酸和溶血磷脂級聯(lián)反應,釋放一系列炎癥因子,促進炎癥反應。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),c PLA2α在乳腺癌和肝癌患者組織中高表達,并且c PLA2α在乳腺癌細胞運動侵襲,肝癌細胞運動及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中具有重要作用。為了系統(tǒng)性地研究c PLA2α在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,我們利用先進的TALEN技術(shù)構(gòu)建了c PLA2α基因敲除小鼠模型,繁殖得到基因敲除純合子,并對其進行一系列的鑒定,最后通過體內(nèi)實驗證實c PLA2α在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用。方法:1.分析c PLA2α基因序列,設計TALEN打靶載體,利用PCR與Golden Gate法組裝TALEN載體;2.將TALEN載體體外轉(zhuǎn)錄的m RNA注射入小鼠受精卵中,經(jīng)母鼠代孕及與野生型雜交后獲得TALEN敲除F0及F1代小鼠;3.利用F1代基因敲除雜合子小鼠進行大規(guī)模的飼養(yǎng)繁殖;4.提取幼鼠腳趾DNA,經(jīng)PCR與測序后鑒定幼鼠基因型,得到c PLA2α基因敲除純合子小鼠;5.提取基因敲除純合子、雜合子及野生型小鼠組織蛋白,Western Blotting檢測c PLA2α蛋白表達水平,驗證基因敲除效果;6.收集三種基因型小鼠的代謝物,進行UPLC/Q-TOF-MS后分析代謝組學數(shù)據(jù),尋找組間差異較大的代謝物;7.構(gòu)建小鼠Lewis肺癌模型,證實c PLA2α在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用;DEN誘導小鼠肝癌模型,研究c PLA2α在肝癌發(fā)生中的作用。結(jié)果:1.選取c PLA2α基因中的外顯子3作為TALEN靶標,成功構(gòu)建了TALEN-L和TALEN-R載體;2.顯微注射后得到3只陽性F0代小鼠,與野生型雜交后得到共7只F1代雜合子小鼠,分別缺失三種片段;3.利用4只F1代雜合子,經(jīng)過8個月的飼養(yǎng)繁殖,總計生產(chǎn)34次,獲得226只幼鼠;4.對每只小鼠標記及鑒定后,共得到c PLA2α基因敲除純合子小鼠36只;5.c PLA2α敲除純合子小鼠組織中,c PLA2α蛋白不表達,c PLA2α敲除雜合子小鼠c PLA2α蛋白表達水平比野生型低;6.代謝組學結(jié)果顯示,花生四烯酸、溶血磷脂酸、前列腺素、白三烯、血栓素等代謝物在組間差異較大,可以將野生組與雜合組、純合組的樣本進行很好的區(qū)分;7.Lewis肺癌模型證實,c PLA2α敲除對腫瘤的生長無明顯影響,但幾乎完全抑制了腫瘤的肝轉(zhuǎn)移;DEN在野生型和c PLA2α敲除小鼠中均成功誘導了肝癌。結(jié)論:1.利用TALEN技術(shù)成功構(gòu)建了c PLA2α基因敲除小鼠,得到F1代基因敲除雜合子;2.繁殖得到了c PLA2α基因敲除純合子小鼠,為后續(xù)研究c PLA2α與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供了重要的動物模型;3.從基因水平和蛋白水平兩個方面對基因敲除純合子小鼠進行了鑒定與驗證;4.代謝組學分析了c PLA2α基因敲除所引起的代謝物改變,間接證實了基因敲除模型構(gòu)建的成功,也為更深入的研究c PLA2α的生理功能提供了更多潛在標志物;5.c PLA2α基因敲除可顯著抑制腫瘤的體內(nèi)轉(zhuǎn)移;成功構(gòu)建了DEN肝癌誘導模型。
【關(guān)鍵詞】：cPLA2α 基因敲除 TALEN 純合子 鑒定 代謝組學
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語10-12
• 前言12-16
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-16
• 對象和方法16-29
• 1.1 實驗材料16-20
• 1.1.1 實驗動物16
• 1.1.2 常用試劑耗材16-17
• 1.1.3 主要試劑及溶液的配置17-19
• 1.1.4 主要儀器設備19-20
• 1.2 實驗方法20-29
• 1.2.1 TALEN載體的構(gòu)建20-21
• 1.2.2 顯微注射及F0、F1代小鼠鑒定21
• 1.2.3 基因敲除小鼠的飼養(yǎng)與繁殖21-22
• 1.2.4 小鼠基因型鑒定22-24
• 1.2.5 小鼠c PLA2α蛋白表達水平鑒定24-26
• 1.2.6 代謝組學分析26-28
• 1.2.7 Lewis肺癌模型驗證c PLA2α敲除對腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響28
• 1.2.8 小鼠DEN誘導肝癌模型的建立28-29
• 結(jié)果29-42
• 2.1 TALEN載體構(gòu)建29-30
• 2.2 顯微注射F0及F1代小鼠情況30-32
• 2.3 小鼠繁殖生長情況32-33
• 2.4 小鼠基因型鑒定33-34
• 2.5 小鼠cPLA2α蛋白表達水平檢測34-35
• 2.6 UPLC-QTOF質(zhì)譜35
• 2.7 代謝組學分析35-39
• 2.8 lewis肺癌模型中cLPA2α敲除對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響39-40
• 2.9 小鼠DEN誘導肝癌模型的建立40-42
• 討論42-47
• 3.1 c PLA2α在腫瘤中的作用研究42-43
• 3.2 TALEN技術(shù)構(gòu)建基因敲除小鼠的優(yōu)勢與限制43-44
• 3.3 基因敲除小鼠飼養(yǎng)繁殖中的問題44
• 3.4 代謝組學分析44-45
• 3.5 c PLA2α基因敲除小鼠的應用前景45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻48-53
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明53-54
• 附錄54-60
• 綜述 基因敲除技術(shù)的研究進展60-78
• 綜述參考文獻72-78
• 致謝78-79
• 個人簡歷79

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本文編號：623081