本文關鍵詞：花絨寄甲methuselah-like基因的克隆和表達研究

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【摘要】：花絨寄甲Dastarcus helophoroides(Fairmaire)隸屬于鞘翅目Coleoptera穴甲科Bothrideridae,是天牛類、吉丁類和象甲類等蛀干害蟲的有效天敵昆蟲;與其他昆蟲相比,花絨寄甲成蟲擁有較長的壽命,在實驗室人工飼養(yǎng)條件下可存活8年以上。methuselah(mth)是一類重要的受體基因,與昆蟲的壽命、生殖能力和抗逆能力相關,但僅存在于果蠅Drosophila;隨后發(fā)現(xiàn)的大量mth同源基因mth-like廣泛存在于各類昆蟲,但到目前為止在花絨寄甲中還未見報道。本研究在對mth-like進行檢索的基礎上,采用RACE-PCR技術進行全長擴增,運用多種生物信息學工具對其進行分析,并采用RT-qPCR技術對其在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況進行解析。主要結果如下:1.在對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行檢索,獲得6條相應mth-like序列片段的基礎上,對序列進行3’和5’RACE擴增,最后得到6條mth-like全長序列。將序列分別命名為mth-like1、mth-like2-1、mth-like2-2、mth-like2-3、mth-like5-1和mth-like5-2,將對應的氨基酸序列分別命名為Mth-like1、Mth-like2-1、Mth-like2-2、Mth-like2-3、Mth-like5-1和Mth-like5-2。2.在線預測和多序列比對結果表明6條序列均具有保守的七次跨膜結構;系統(tǒng)進化分析表明,Mth-like1、Mth-like2-1、Mth-like2-2、Mth-like5-1和Mth-like5-2都與赤擬谷盜的進化關系最近,Mth-like2-3則與膜翅目昆蟲最近。3.RT-qPCR分析表明,6條基因在各發(fā)育階段和不同組織均有表達,但表達圖譜呈現(xiàn)出較大差異性。6條基因的表達量在成蟲衰老的過程中均呈規(guī)律性變化,除mth-like2-1后期(20-30個月)表達量顯著低于正常水平外,其余基因的表達量要么恢復到了正常水平(mth-like2-2),要么升高到較高水平(mth-like1、mth-like2-3、mth-like5-1和mth-like5-2)。mth-like1、mth-like2-1、mth-like2-2、和mth-like2-3對氧化脅迫均有響應,并表現(xiàn)出時間效應,推測這些基因可能與花絨寄甲的抗氧化能力有關;mth-like2-1、mth-like2-2和mth-like2-3對高溫脅迫有響應,推測這些基因可能與花絨寄甲的抗高溫能力相關;在饑餓脅迫下,6條基因的表達量均呈規(guī)律性變化,推測這些基因可能都與成蟲的抗饑餓能力相關。
【關鍵詞】：花絨寄甲 mth-like基因 RACE-PCR擴增 RT-qPCR定量表達
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S763.306.4
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻綜述12-19
• 1.1 花絨寄甲簡介12-14
• 1.1.1 花絨寄甲生物學習性12
• 1.1.2 花絨寄甲人工繁育12-13
• 1.1.3 花絨寄甲對天牛的防治效果13
• 1.1.4 花絨寄甲衰老機制13-14
• 1.2 Mth/Mth-like受體家族14-17
• 1.2.1 mth/mth-like基因的發(fā)現(xiàn)14
• 1.2.2 Mth/Mth-like受體的結構14-15
• 1.2.3 Mth/Mth-like受體的配體和信號轉(zhuǎn)導通路15-16
• 1.2.4 Mth/Mth-like受體的分布和生理功能16-17
• 1.3 研究內(nèi)容和目的意義17-18
• 1.3.1 研究內(nèi)容17
• 1.3.2 研究的目的意義17-18
• 1.4 技術路線18-19
• 第二章 花絨寄甲mth-like基因的檢索和克隆19-26
• 2.1 材料和方法19-23
• 2.1.1 供試蟲源19
• 2.1.2 主要試劑與儀器19
• 2.1.3 花絨寄甲mth-like基因的檢索19-20
• 2.1.4 花絨寄甲成蟲總RNA提取和質(zhì)量檢測20-21
• 2.1.5 花絨寄甲mth-like基因片段的全長擴增21-23
• 2.2 結果與分析23-24
• 2.2.1 花絨寄甲mth-like基因的檢索結果23-24
• 2.2.2 花絨寄甲mth-like基因片段的擴增結果24
• 2.3 小結24-25
• 2.4 討論25-26
• 第三章 花絨寄甲mth-like基因的生物信息學分析26-32
• 3.1 分析方法26
• 3.1.1 序列特征分析26
• 3.1.2 系統(tǒng)進化分析26
• 3.2 分析結果26-30
• 3.2.1 氨基酸序列特征分析26-28
• 3.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析28-30
• 3.3 小結30-31
• 3.4 討論31-32
• 第四章 花絨寄甲mth-like基因的表達模式分析32-48
• 4.1 材料和方法32-36
• 4.1.1 供試蟲源32
• 4.1.2 主要試劑與儀器32
• 4.1.3 不同發(fā)育階段花絨寄甲的收集32
• 4.1.4 花絨寄甲成蟲的解剖與組織的收集32-33
• 4.1.5 不同存活時間花絨寄甲成蟲的收集33
• 4.1.6 氧化脅迫處理33
• 4.1.7 高溫脅迫處理33
• 4.1.8 饑餓脅迫處理33-34
• 4.1.9 總RNA的提取和第一鏈c DNA的合成34
• 4.1.10 內(nèi)參基因的選擇和引物設計34-35
• 4.1.11 引物熔解曲線和擴增效率分析35
• 4.1.12 定量PCR（RT-q PCR）35
• 4.1.13 數(shù)據(jù)分析35-36
• 4.2 結果與分析36-44
• 4.2.1 擴增產(chǎn)物熔解曲線和引物擴增效率36
• 4.2.2 花絨寄甲不同發(fā)育階段mth-like基因的表達36-38
• 4.2.3 花絨寄甲成蟲不同組織mth-like基因的表達38-39
• 4.2.4 不同存活時間花絨寄甲成蟲mth-like基因的表達39-40
• 4.2.5 氧化脅迫下花絨寄甲成蟲mth-like基因的表達40-42
• 4.2.6 高溫脅迫下花絨寄甲成蟲mth-like基因的表達42-44
• 4.2.7 饑餓脅迫下花絨寄甲成蟲mth-like基因的表達44
• 4.3 小結44-46
• 4.4 討論46-48
• 第5章 主要結論、創(chuàng)新點和研究展望48-50
• 5.1 主要結論48-49
• 5.1.1 克隆獲得6條mth-like全長序列48
• 5.1.2 解析了mth-like基因在不同蟲態(tài)的表達模式48
• 5.1.3 解析了mth-like基因的組織分布模式48-49
• 5.1.4 明確了mth-like基因表達隨成蟲衰老的變化模式49
• 5.1.5 明確了mth-like基因表達對不同脅迫的響應模式49
• 5.2 創(chuàng)新點49
• 5.3 研究展望49-50
• 參考文獻50-55
• 致謝55-56
• 作者簡介56

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本文編號：615988