本文關(guān)鍵詞：外源KCS酶基因轉(zhuǎn)化富油新綠藻的初步研究

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【摘要】：為了探討β-酮脂酰輔酶A合酶(KCS)在微藻超長鏈脂肪酸合成調(diào)控中的作用,提高微藻中的超長鏈脂肪酸的含量,本文以富油新綠藻(Neochloris oleoabundans)為研究對象,采用農(nóng)桿菌介導法將銀扇草的KCS酶基因遺傳轉(zhuǎn)化到微藻中,并對遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果進行分析,對轉(zhuǎn)化后微藻油脂的脂肪酸組成進行了分析檢測,對轉(zhuǎn)化KCS基因?qū)φ{(diào)控微藻脂肪酸組成的作用進行了分析。本文是首次以富油新綠藻為工作對象的基因工程研究,實現(xiàn)了外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化,此項工作為富油新綠藻的進一步基因工程研究打下了基礎(chǔ)。本文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)研究了富油新綠藻對五種抗生素的敏感性。分別在液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)條件下,研究了富油新綠藻對氯霉素、青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、潮霉素五種抗生素的敏感性。結(jié)果表明,在液體培養(yǎng)條件下,鏈霉素和潮霉素在濃度為10μg/m L時可以完全抑制藻細胞的生長,氯霉素和四環(huán)素在濃度為100μg/m L時表現(xiàn)出抑制作用,青霉素在500μg/m L才表現(xiàn)出輕微的抑制作用。固體培養(yǎng)條件的研究結(jié)果與液體培養(yǎng)條件的結(jié)果基本一致。(2)成功構(gòu)建了2個用于農(nóng)桿菌介導法遺傳轉(zhuǎn)化的雙元表達載體。以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化常用的質(zhì)粒載體p CAMBIA1301-為基礎(chǔ),分別以花椰菜花葉病毒啟動子Ca MV35S和萊茵衣藻偏好的融合啟動子Hsp70A/Rbcs2構(gòu)建KCS基因的表達盒,得到2個表達載體p CAMBIA1301-KCS、p CAMBIA1301-Rbcs2-KCS。同時,這兩個載體還含有β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)作為報告基因和篩選標記基因。(3)通過攜帶重組質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌與富油新綠藻細胞共培養(yǎng)的方法,實現(xiàn)目標基因向富油新綠藻的遺傳轉(zhuǎn)化。首先,通過電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,挑選出成功攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株。然后,將攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與富油新綠藻共培養(yǎng),使重組質(zhì)粒中的T-DNA轉(zhuǎn)入富油新綠藻基因組。最后,以含潮霉素10μg/m L的培養(yǎng)基平板對與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的藻細胞做篩選培養(yǎng),得到在篩選平板上生長的獲得了潮霉素抗性的藻落。(4)對篩選出來的陽性轉(zhuǎn)基因藻株進行基因檢測、培養(yǎng)和脂肪酸分析。通過PCR檢測,結(jié)果顯示GUS基因、潮霉素基因、KCS基因、融合啟動子都成功轉(zhuǎn)入藻基因組中。通過RT-PCR檢測,顯示幾種外源基因都成功轉(zhuǎn)錄。GUS染色結(jié)果顯示,GUS基因成功表達,通過抗性也驗證了潮霉素基因成功表達。但是,轉(zhuǎn)基因藻脂肪酸組成分析表明超長鏈脂肪酸含量沒有變化,這有待進一步分析。
【關(guān)鍵詞】：富油新綠藻 微藻 KCS 農(nóng)桿菌 超長鏈脂肪酸
【學位授予單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q949.2;TQ645.6
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 主要縮略詞及其含義10-11
• 1 綜述11-22
• 1.1 微藻及其應用11-13
• 1.1.1 微藻的一般生物學特點11
• 1.1.2 微藻的主要應用11-12
• 1.1.3 微藻應用的進展和問題12-13
• 1.2 富油新綠藻13-14
• 1.2.1 富油新綠藻的生物學特性13
• 1.2.2 富油新綠藻的研究進展13-14
• 1.3 KCS酶及其作用14-17
• 1.3.1 植物脂肪酸代謝調(diào)控機制14-16
• 1.3.2 KCS酶的研究進展16-17
• 1.4 微藻轉(zhuǎn)基因工程研究進展17-20
• 1.4.1 微藻基因工程研究現(xiàn)狀17-18
• 1.4.2 微藻基因工程的主要技術(shù)18-20
• 1.5 選題意義與研究主要內(nèi)容20-22
• 1.5.1 選題意義20
• 1.5.2 研究內(nèi)容20-22
• 2 富油新綠藻對五種抗生素敏感性研究22-30
• 2.1 材料與方法22-23
• 2.1.1 實驗材料22
• 2.1.2 實驗儀器22-23
• 2.1.3 實驗方法23
• 2.2 結(jié)果與討論23-29
• 2.2.1 富油新綠藻對氯霉素的敏感性23-24
• 2.2.2 富油新綠藻對青霉素的敏感性24-25
• 2.2.3 富油新綠藻對鏈霉素的敏感性25-26
• 2.2.4 富油新綠藻對四環(huán)素的敏感性26-27
• 2.2.5 富油新綠藻對潮霉素的敏感性27-28
• 2.2.6 討論28-29
• 2.3 小結(jié)29-30
• 3 表達載體的構(gòu)建30-38
• 3.1 材料與方法30-35
• 3.1.1 實驗材料30-31
• 3.1.2 實驗儀器31
• 3.1.3 實驗方法31-35
• 3.2 結(jié)果與討論35-37
• 3.2.1 載體pCAMBIA1301-KCS的菌落PCR鑒定35-36
• 3.2.2 載體pCAMBIA1301-KCS酶切鑒定36
• 3.2.3 載體pCAMBIA1301-Rbcs2-KCS的菌落PCR鑒定36-37
• 3.2.4 載體pCAMBIA1301-Rbcs2-KCS酶切鑒定37
• 3.3 小結(jié)37-38
• 4 農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化富油新綠藻38-54
• 4.1 材料與方法38-43
• 4.1.1 實驗材料38-39
• 4.1.2 實驗儀器39
• 4.1.3 實驗方法39-43
• 4.2 結(jié)果與討論43-52
• 4.2.1 重組質(zhì)粒對農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化43-44
• 4.2.2 含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化富油新綠藻44-45
• 4.2.3 陽性克隆藻株P(guān)CR鑒定45-48
• 4.2.4 轉(zhuǎn)基因藻株RT-PCR檢測48-49
• 4.2.5 轉(zhuǎn)基因藻株的潮霉素基因表達驗證49-50
• 4.2.6 轉(zhuǎn)基因藻株的GUS基因表達驗證50-51
• 4.2.7 轉(zhuǎn)基因富油新綠藻脂肪酸的測定51-52
• 4.2.8 討論52
• 4.3 小結(jié)52-54
• 5 結(jié)論與展望54-56
• 5.1 結(jié)論54
• 5.2 創(chuàng)新點54
• 5.3 展望54-56
• 參考文獻56-66
• 致謝66-67
• 作者簡介67-68
• 導師簡介68

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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本文編號：607278