本文關鍵詞：光敏色素基因在轉基因玉米株系基因組的整合位點

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【摘要】：外源基因或表達結構的插入位點及整合方式,不僅關系外源基因的表達,而且可能引起插入位點突變,影響內源基因表達,是轉基因機理研究和安全性評價的重要內容。玉米基因組比擬南芥和水稻等模式植物更為復雜,而且存在大量的重復序列和轉座序列。因此,在玉米轉基因研究中,外源基因插入位點及整合方式的鑒定更為重要,也更為困難。本實驗以農(nóng)桿菌介導法轉化玉米內源光敏色素基因Phy A1、PhyA2和PhyB1的6個不同世代株系和陽性株為材料,經(jīng)特異PCR純合性檢驗后,用高效熱不對稱交錯式PCR擴增T-DNA整合位點的側翼序列,分析T-DNA的玉米基因組中的整合規(guī)律,討論其對表現(xiàn)型的影響。所得結果如下：1.用兩套巢式物分別擴增相應的選擇標記基因及其啟動子序列片段,表達載體pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos和pCAMBIA 1390-Ubi-PhyB1-T-nos分別轉化的T7代株系全部為陽性植株,純合率為100%。表達載體pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos轉化的T6代株系大部分為陽性植株,純合率為90%。表達載體pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉化的T3代株系純合率為40%。在表達載體pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉化To代植株中,檢測出2個獨立的陽性植株,陽性率為5%。2.hiTAIL-PCR和基因組步移擴增及序列分析結果,pCAMBIA1390-Ubi-PhyAl-T-nos轉化T7代株系、pCAMBIA 1390-Ubi-PhyB1-T-nos轉化T7代株系、pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos轉化T6代株系、pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉化T3代株系以及pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉化T0代陽性株1和2的T-DNA整合位點,分別位于玉米基因組第1染色體第284557834與284557835堿基、第9染色體第61944355與61944356堿基、第1染色體第26981167與26981168堿基、第6染色體第96491356與96491357堿基、第3染色體第125567445與125567446堿基和第4染色體第98934902與98934903堿基之間。3.根據(jù)上述6個轉基因株系或T0代陽性株的T-DNA整合位點,在玉米基因組序列數(shù)據(jù)庫中搜索上下游10 kb以內的功能基因序列、重復序列和轉座子序列。結果表明,pCAMBIA1390-Ubi-PhyAl-T-T-nos和pCAMBIA 1390-Ubi-PhyB1-T-nos分別轉化T7代株系,pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos轉化T6代株系和pTF101.1一Ubi-PhyB1-T-nos轉化T0代陽性株2的T-DNA整合位點,_上-下游10 kb范圍未發(fā)現(xiàn)功能基因序列、重復序列和轉座子序列。pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉化T3代株系的T-DNA整合位點下游1050 bp有一編碼WRKY40轉錄因子的基因,上游70 kb還有一個功能未知基因。pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉化T0代陽性株1的T-DNA整合位點下游20 bp有一編碼精氨酸t(yī)RNA的基因,上游200 bp還有一個基因功能未知基因。4.上述6個轉基因株系和T0代陽性株T-DNA左右邊界共12個整合位點,共有4種整合模式：(1) T-DNA整合的斷裂點發(fā)生在邊界序列內,整合進玉米基因組的T-DNA不附帶表達載體骨架和填充序列。(2) T-DNA整合的斷裂點發(fā)生在邊界序列以外,整合進玉米基因組的T-DNA附帶部分表達載體骨架序列。(3) T-DNA邊界與玉米基因組序列之間填充進一段與表達載體和玉米基因組均不同源的序列。(4) T-DNA整合的斷裂點發(fā)生在邊界序列以內,造成T-DNA邊界序列的缺失。此外,在這12個整合的T-DNA左右邊界序列中,均發(fā)現(xiàn)不同程度的堿基替代和缺失突變。綜上所述,T-DNA在玉米基因組的整合位點和模式是多種多樣的,每一轉化事件各不相同。對于T-DNA整合位點接近或重合于功能基因序列的情況,在轉基因安全性評價中應專門進行基因表達檢測。表達載體pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos和pCAMBIA1390-Ubi-PhyB1-T-nos分別轉化的T7代株系出現(xiàn)的株高和穗位高等性狀的改變,是由過量表達的內源基因ZmPhyA1和ZmPhyB1引起。
【關鍵詞】：基因組 整合位點 玉米 光敏色素基因 轉基因
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1. 文獻綜述11-19
• 1.1 T-DNA整合特點12-13
• 1.1.1 T-DNA修復模型12-13
• 1.1.2 T-DNA整合對受體基因組的影響13
• 1.2 T-DNA整合模式研究進展13-15
• 1.3 熱不對稱交錯式PCR15-18
• 1.3.1 TAIL-PCR原理15-16
• 1.3.2 hiTAIL-PCR的優(yōu)點16-17
• 1.3.3 基因組步移17-18
• 1.4 目的意義18-19
• 2. 材料和方法19-28
• 2.1 基因組DNA提取19
• 2.2 轉基因株系的純合性檢測19-22
• 2.3 hiTAIL-PCR擴增22-24
• 2.3.1 引物設計22-23
• 2.3.2 hiTAIL-PCR第一輪擴增23
• 2.3.3 hiTAIL-PCR第二輪擴增23
• 2.3.4 hiTAIL-PCR第三輪擴增23-24
• 2.3.5 凝膠電泳分離24
• 2.4 特異片段的亞克隆及測序24-25
• 2.4.1 亞克隆載體連接24
• 2.4.2 感受態(tài)細胞制備24
• 2.4.3 感受態(tài)細胞的轉化24-25
• 2.4.4 特異片段的亞克隆及測序25
• 2.5 基因組序列比對25-26
• 2.5.1 側翼序列與表達載體比對25
• 2.5.2 側翼序列與玉米基因組比對25-26
• 2.5.3 邊界序列與填充序列分析26
• 2.6 基因組步移26-28
• 3. 結果與分析28-41
• 3.1 轉基因株系的純合性28-29
• 3.2 hiTAIL-PCR擴增的特異片段29-31
• 3.3 T-DNA整合位點31-37
• 3.3.1 pCAMBIA1390-Ubi-PhyB1-T-nos轉化的T_7代株系31
• 3.3.2 pTF101.1-Ubi-PhyAl-T-nos轉化的T_6代株系31-32
• 3.3.3 pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉化的T_3代株系32-33
• 3.3.4 pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉化的T_0代陽性株133-34
• 3.3.5 pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos轉化的T_7代株系34-36
• 3.3.6 pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉化的T_0代陽性株236-37
• 3.4 整合位點側翼的玉米基因組序列37-39
• 3.5 邊界序列在整合中的突變39-41
• 4. 討論41-43
• 4.1 T-DNA整合模式41-42
• 4.2 T-DNA整合對受體基因的影響42-43
• 5. 參考文獻43-48
• 致謝48-49
• 附錄49-55
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文55

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本文編號：577094