本文關(guān)鍵詞：日本沼蝦抗菌肽基因的篩選和生物信息學(xué)分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,ALF)是存在于甲殼動(dòng)物和馬蹄蟹中的一種具有廣譜抗菌活性和抗病毒活性的抗菌肽。本研究中,我們通過(guò)從已經(jīng)建立的日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組中分析篩選出6種ALF基因序列,分別命名為MnALF1-6,并通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增的方法克隆了它們的全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)分子系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,這些基因的產(chǎn)物都與羅氏沼蝦同系物具有很高的相似性,尤其在LPS結(jié)構(gòu)域部分。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,在健康成蝦的血細(xì)胞中MnALF2和MnALF4的相對(duì)表達(dá)量最高,在腸道中MnALF3和MnALF4的相對(duì)表達(dá)量最高。在嗜水氣單胞菌的免疫誘導(dǎo)下,沼蝦不同組織中少數(shù)ALF基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá),但多數(shù)ALF基因呈上調(diào)表達(dá)模式。為了驗(yàn)證ALF的抗菌活性與LPS結(jié)構(gòu)域的關(guān)系,我們合成了MnALF2的LPS結(jié)構(gòu)域部分肽段,用來(lái)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)和溶血活性實(shí)驗(yàn)�？咕钚詫�(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)合成的MnALF2多肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌具有強(qiáng)大的廣譜抗菌活性,但對(duì)真菌沒(méi)有明顯的抑制活性。溶血實(shí)驗(yàn)中合成的MnALF2多肽在濃度為0.67-33.50μM時(shí)表現(xiàn)出較弱的溶血活性(約10%),在濃度達(dá)到67μM時(shí)溶血活性約為22%。這項(xiàng)研究有利于我們更深入的了解淡水蝦先天免疫中ALFs的抗菌作用,并表明這些抗菌肽或其衍生物有可能成為一種高效的新型抗菌藥物。利用本地庫(kù)比對(duì)程序,在日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組中查找羅氏沼蝦Crustin基因的同源序列,比對(duì)結(jié)果顯示日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組中存在13條與羅氏沼蝦Crustin相似性很高的序列。我們對(duì)這13條序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示這13條序列都具有乳清酸蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域且大多都存在信號(hào)肽,因此推測(cè)這13條序列應(yīng)該是日本沼蝦中存在的Crustin基因序列,并將其命名為MnCrustin1-13。日本沼蝦Crustins是富含半胱氨酸的陽(yáng)離子多肽,且一般在N端包含一個(gè)功能域(富含甘氨酸,脯氨酸或半胱氨酸),在C端含有一個(gè)帶有4個(gè)二硫鍵的乳清酸蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域。
【關(guān)鍵詞】：抗脂多糖因子 先天性免疫 抗菌活性 Crustin 日本沼蝦 序列多樣性
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 前言10-20
• 1.1 抗菌肽10-11
• 1.2 昆蟲抗菌肽11-13
• 1.3 甲殼動(dòng)物抗菌肽13-19
• 1.3.1 Crustin15-17
• 1.3.2 抗脂多糖因子17-19
• 1.4 日本沼蝦及其研究意義19-20
• 第二章 抗脂多糖因子的鑒定和功能分析20-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-21
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑20
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)菌種20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-25
• 2.2.1 日本沼蝦總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄21
• 2.2.2 克隆日本沼蝦ALFs基因的cDNA序列21-22
• 2.2.3 MnALFs基因序列的分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建22-23
• 2.2.4 日本沼蝦的免疫誘導(dǎo)和組織的收集23
• 2.2.5 提取組織總RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR23
• 2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析23
• 2.2.7 合成多肽MnALF2的抗菌活性實(shí)驗(yàn)23-24
• 2.2.8 合成多肽MnALF2的溶血活性測(cè)定24-25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-34
• 2.3.1 MnALFs的克隆及同源性分析25-28
• 2.3.2 MnALFs結(jié)構(gòu)分析28-29
• 2.3.3 MnALFs的表達(dá)模式分析29-32
• 2.3.4 MnALF2合成肽的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-33
• 2.3.5 MnALF2合成肽溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-34
• 2.4 討論34-37
• 第三章 MnCrustin的生物信息學(xué)分析37-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)方法37
• 3.1.1 MnCrustins基因序列的生物信息學(xué)分析37
• 3.1.2 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-42
• 3.2.1 日本沼蝦Crustin基因cDNA序列分析37-39
• 3.2.2 日本沼蝦Crustin基因的系統(tǒng)發(fā)育及蛋白結(jié)構(gòu)分析39-42
• 3.3 討論42-43
• 第四章 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 致謝51-52
• 攻讀學(xué)位期間取得的成果52

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