本文關(guān)鍵詞：奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮細胞的表達定位及對SCD1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)作為核轉(zhuǎn)錄因子,對于細胞脂肪合成酶基因的表達發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。論文旨在奶牛乳腺上皮細胞中研究SREBP1對于SCD1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,為進一步明確SREBP1對于靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)�！痉椒ā恳院伤固鼓膛Ｈ橄俳M織的c DNA為模板,采用分段克隆的方法獲得SREBP1基因的編碼序列,通過重組酶與pc DNA3.1載體進行重組環(huán)化構(gòu)建pc DNA3.1-SREBP1表達載體,將構(gòu)建的載體測序驗證后提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細胞。以EIF3K基因為內(nèi)參基因,采用熒光定量PCR檢測SREBP1基因m RNA的表達差異;采用免疫熒光的方法對SREBP1進行標記,以DAPI復染細胞核,激光共聚焦觀察SREBP1蛋白的亞細胞定位;轉(zhuǎn)染含有不同調(diào)控元件的SCD基因啟動子,同時轉(zhuǎn)染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作為處理,熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析啟動子活性;分別轉(zhuǎn)染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1載體,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3啟動子活性與SREBP1之間的量效關(guān)系�！窘Y(jié)果】分段克隆得到的PCR產(chǎn)物分別為1 170、1 116、363和900 bp的片段,經(jīng)過與pc DNA3.1載體重組后獲得pc DNA3.1-SREBP1表達載體,經(jīng)酶切和測序驗證,發(fā)現(xiàn)除1個無義突變外,與標準序列完全相同,整個序列長度達到3 510bp;將pc DNA3.1-SREBP1載體轉(zhuǎn)染乳腺上皮細胞后,Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染空載體的對照組相比,SREBP1基因的m RNA表達倍數(shù)增強130.4倍(P0.001);激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn),DAPI染色的細胞核呈藍色,免疫熒光標記的SREBP1呈綠色,二者融合后呈現(xiàn)青色,共定位在乳腺上皮細胞核中;啟動子活性檢測發(fā)現(xiàn),與p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1處理能夠極顯著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4啟動子的活性(P0.001),分別比對照組提高了1.0倍和0.7倍,進一步分析發(fā)現(xiàn),在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1處理后,與p GL3-SCD2的啟動子活性持續(xù)下降相比,p GL3-SCD3的啟動子活性從59.81上升到108.43(P0.001),二者存在劑量效應關(guān)系,結(jié)合SCD2和SCD 3啟動子上主要的結(jié)構(gòu)差異SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推測此序列可能是SREBP1調(diào)控SCD基因啟動子轉(zhuǎn)錄的結(jié)合序列�！窘Y(jié)論】克隆構(gòu)建奶牛SREBP1基因表達載體,亞細胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮細胞核中,SREBP1可以與SRE調(diào)控元件結(jié)合促進SCD1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄。
【作者單位】： 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院/農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點實驗室;
【關(guān)鍵詞】： 奶牛 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 乳腺上皮細胞 亞細胞定位 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【基金】：國家“973”項目(2011CB100802) 國家自然科學基金(31072009) 國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2014ZX0801015B) 河南省高等學校重點科研項目(15A230020) 河南省基礎(chǔ)與前沿項目(162300410258)
【分類號】：S823
【正文快照】： Expression and Localization of Bovine SREBP1 Protein andRegulation of the Transcription of SCD1 Promoter in BovineMammary Epithelial CellHAN Li-qiang,WANG Yue-ying,WANG Lin-feng,ZHU He-shui,ZHONG Kai,CHU Bei-bei,YANG Guo-yu(College of Animal Science and

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本文編號：449896