目的構建E3泛素化連接酶環(huán)指與WD重復結構域蛋白(RING finger and WD repeat domain,RFWD3)的慢病毒表達載體,研究RFWD3對宮頸癌細胞增殖與遷移能力的影響。方法以宮頸癌HeLa細胞的cDNA為模板擴增RFWD3基因片段,利用DNA重組技術,將上述片段克隆至慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(簡稱pCDH)中,構建pCDH-RFWD3重組真核表達質粒。經(jīng)酶切及測序驗證準確后,采用三質粒慢病毒包裝系統(tǒng)包裝RFWD3病毒,通過梯度稀釋法感染人胚腎上皮細胞(293T)檢測病毒滴度。隨后采用RFWD3慢病毒液感染宮頸癌HeLa細胞,運用Western blot實驗檢測慢病毒轉導后HeLa細胞中RFWD3蛋白的表達水平,進一步通過CCK-8和細胞劃痕實驗檢測過表達RFWD3蛋白對HeLa細胞增殖與遷移能力的影響。結果可表達RFWD3蛋白的pCDH-RFWD3慢病毒載體獲成功構建。包裝RFWD3慢病毒,建立穩(wěn)定表達RFWD3蛋白的宮頸癌HeLa細胞系。RFWD3慢病毒轉導后的HeLa細胞與對照細胞相比,其細胞增殖與遷移能力顯著增強(P<...

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圖1PCR擴增RFWD3基因后的核酸電泳圖

對穩(wěn)定的、成功感染后的pCDH及pCDH-RFWD3HeLa細胞,采用CCK-8法進行細胞增殖能力的測定。結果顯示,從第3天開始,過表達RFWD3蛋白的HeLa細胞增殖能力增強(P<0.05)。見圖8。劃痕實驗結果表明,過表達RFWD3的HeLa細胞在細胞接種24h后,其遷....

圖2質粒pCDH-RFWD3雙酶切鑒定的核酸電泳圖

圖1PCR擴增RFWD3基因后的核酸電泳圖圖3RFWD3重組質粒共轉染293T細胞后GFP的表達(×100)

圖3RFWD3重組質粒共轉染293T細胞后GFP的表達(×100)

圖2質粒pCDH-RFWD3雙酶切鑒定的核酸電泳圖圖4不同稀釋度的RFWD3慢病毒感染293T細胞后GFP的表達(×100)

圖4不同稀釋度的RFWD3慢病毒感染293T細胞后GFP的表達(×100)

圖3RFWD3重組質粒共轉染293T細胞后GFP的表達(×100)圖5不同稀釋度的pCDH慢病毒感染293T細胞后GFP的表達(×100)

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