基因敲除或者敲入是研究基因功能最為有效的途徑,在細胞或生物體基因組上進行高效、精確的編輯一直是限制該領(lǐng)域快速發(fā)展的瓶頸。傳統(tǒng)的基于同源重組的基因打靶技術(shù)由于效率低、費用高等問題限制了其廣泛應(yīng)用。由于在特異位點引入雙鏈DNA缺口(DSBs)可提高同源重組的效率,研究和開發(fā)能夠在基因組特定位點進行切割的人工核酸酶就成為生物技術(shù)領(lǐng)域的關(guān)鍵問題。CRISPR/Cas9是繼鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)后可用于基因組高效編輯的第三代人工核酸酶。CRISPR/Cas9是RNA介導(dǎo)的核酸酶,能夠通過替換sgRNA進行人為設(shè)計,實施靶位點特異性切割產(chǎn)生DSBs,激發(fā)細胞同源重組修復(fù)機制或者非同源末端連接修復(fù)機制,進而實現(xiàn)基因組的定點敲除、定點敲入和基因修飾。維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)是一種核轉(zhuǎn)錄因子,廣泛存在于多種組織中,與活性維生素D3結(jié)合后被激活,通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和刺激細胞內(nèi)不同信號通路發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)作用。VDR主要功能是調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣的平衡、抑制細胞增殖和刺激細胞成熟等,與許多疾病的發(fā)生有關(guān),涉及皮膚、免疫系統(tǒng)、結(jié)腸、乳房和前列腺等多...

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 基因組定點編輯
    1.2 人工鋅指核酸酶
        1.2.1 鋅指蛋白的設(shè)計與組裝
        1.2.2 FokI內(nèi)切酶
        1.2.3 ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用
    1.3 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALENS）
        1.3.1TALE的結(jié)構(gòu)與DNA識別
        1.3.2 TALENs的應(yīng)用
        1.3.3 TALENs特異性與脫靶
    1.4 CRISPR/CAS9系統(tǒng)及應(yīng)用
        1.4.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)基因結(jié)構(gòu)與類型
        1.4.2 CRISPR/Cas的適應(yīng)性免疫機制
        1.4.3 CRISPR/Cas9基因組編輯機制
        1.4.4 CRISPR/Cas9的應(yīng)用
        1.4.5 CRISPR/Cas9在基因組編輯中脫靶問題
    1.5 維生素D受體研究進展
        1.5.1 維生素D受體結(jié)構(gòu)與功能
        1.5.2 VDR調(diào)控基因的表達
        1.5.3 VDR與細胞內(nèi)蛋白因子的相互作用
    1.6 本研究的目的和意義
第二章 VDR基因CRISPR/CAS9打靶系統(tǒng)構(gòu)建
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 試劑
        2.1.3 引物序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 維生素D受體基因（VDR）CRISPR/Cas9打靶位點的選擇
        2.2.2 CRISPR/Cas9表達載體的構(gòu)建
        2.2.3 報告載體的設(shè)計與構(gòu)建
        2.2.4 CRISPR/Cas9活性與報告載體效果驗證
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 CRISPR/Cas9表達載體的鑒定
        2.3.2 CRISPR/Cas9報告載體的鑒定
        2.3.3 CRISPR/Cas9活性與報告載體效果
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 CRISPR/CAS9介導(dǎo)VDR基因編輯
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞株和質(zhì)粒
        3.1.2 試劑和培養(yǎng)基的配制
        3.1.3 PCR引物
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細胞轉(zhuǎn)染與篩選
        3.2.2 細胞基因組DNA提取與PCR擴增
        3.2.3 T7E1酶切檢測
        3.2.4 TA克隆與測序
        3.2.5 數(shù)字PCR檢測大片段刪除及效率
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 CRISPR/Cas9靶向編輯人VDR基因的效率
        3.3.2 CRISPR/Cas9靶向編輯小鼠VDR基因的效率
        3.3.3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)VDR基因大片段刪除
        3.3.4 細胞水平的脫靶效應(yīng)
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 VDR基因敲除小鼠模型的構(gòu)建
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗動物
        4.1.2 實驗試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 sgRNA和Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄
        4.2.2 超數(shù)排卵與受精卵的提取
        4.2.3 假孕受體母鼠的準備
        4.2.4 顯微注射
        4.2.5 受精卵的鑒定與移植
        4.2.6 F0代的鑒定與靶位點突變分析
        4.2.7 F0代VDR敲除鼠脫靶效應(yīng)檢測
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 F0代小鼠生產(chǎn)與靶位點PCR擴增
        4.3.2 F0代小鼠的T7E1檢測
        4.3.3 F0代小鼠靶位點PCR產(chǎn)物測序檢測
        4.3.4 F0代VDR基因敲除鼠脫靶突變檢測
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 VDR基因敲除鼠表型鑒定及相關(guān)基因表達分析
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗動物
        5.1.2 實驗試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 VDR基因敲除鼠和野生型小鼠總RNA提取
        5.2.2 定量PCR檢測VDR及其相關(guān)基因的表達
        5.2.3 免疫熒光檢測VDR在不同組織的表達差異
        5.2.4 表性分析
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 敲除鼠和野生型小鼠VDR基因表達差異
        5.3.2 敲除鼠和野生型小鼠VDR相關(guān)基因表達分析
        5.3.3 敲除鼠表型分析
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 慢病毒注射睪丸生產(chǎn)轉(zhuǎn)CAS9基因小鼠
    6.1 實驗材料
        6.1.1 實驗動物
        6.1.2 細胞系與菌株
        6.1.3 病毒載體與病毒
        6.1.4 實驗試劑
    6.2 實驗方法
        6.2.1 慢病毒質(zhì)粒的制備
        6.2.2 慢病毒包裝與滴度測定
        6.2.3 慢病毒注射小鼠睪丸
        6.2.4 注射后小鼠睪丸組織免疫組化分析
        6.2.5 F0代配種與F1代檢測與分析
    6.3 實驗結(jié)果
        6.3.1 慢病毒滴度檢測
        6.3.2 小鼠睪丸組織免疫組化檢測
        6.3.3 F1代小鼠的PCR檢測
    6.4 討論
    6.5 小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新點
后續(xù)研究
參考文獻
附錄
縮略詞
致謝
作者簡介



本文編號：3961486