目的利用成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因組編輯技術(shù),構(gòu)建Rev-erbβ基因敲除的HEK293細胞系。方法通過單向?qū)NA(sgRNA)介導(dǎo)Cas9蛋白對目的基因靶位點DNA進行特異性的切割,然后經(jīng)DNA同源重組單向?qū)NA或非同源末端連接方式進行修復(fù),以實現(xiàn)對Rev-erbβ基因進行敲入、敲除修飾操作的目的。首先,針對Rev-erbβ基因設(shè)計4個sgRNA,經(jīng)篩選選擇活性較高的sgRNA1及sgRNA2用于構(gòu)建p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1&sgRNA2串聯(lián)載體。然后將p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1&sgRNA2和p Ad-E1/hRev-erbβdonor質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞,通過藥物篩選、克隆化及序列測序獲得整合有外源供體基因片段的一條鏈,另一條鏈為片段缺失的Rev-erbβ基因完全敲除的HEK293(Rev-erbβ-/-)細胞系。最后通過用Western blot法和實時定量PCR對敲除Rev-erbβHEK293細胞系(C3-6)進行檢測。結(jié)...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 質(zhì)粒與細胞株
        1.1.2 試劑與儀器
    1.2 方法
        1.2.1 引物設(shè)計與寡核苷酸合成
        1.2.2 p U6-Rev-erbβsgRNA1-4載體構(gòu)建及sgRNA活性篩選
            1.2.2. 1 p U6-Rev-erbβsgRNA1-4載體構(gòu)建
            1.2.2. 2 p U6-Rev-erbβsgRNA1-4活性檢測
        1.2.3 hRev-erbβ打靶載體的構(gòu)建
        1.2.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        1.2.5 Rev-erbβ穩(wěn)定敲除HEK293細胞系的建立
        1.2.6 Rev-erbβ基因敲除HEK293細胞系的鑒定
            1.2.6. 1 PCR法對Rev-erbβ基因敲除的細胞株基因組水平的鑒定
            1.2.6. 2 實時定量PCR檢測敲除Rev-erbβ基因細胞系的mRNA水平
            1.2.6. 3 Western blot法檢測Rev-erbβ蛋白的表達
2 結(jié)果
    2.1 Rev-erbβsgRNA活性的篩選
    2.2 Rev-erbβ基因敲除的HEK293細胞系的建立與鑒定
3 討論



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