構(gòu)建CBFβ敲除Hep G2細(xì)胞系及CBFβ真核表達(dá)載體。CRISPR/Cas9基因敲除,將表達(dá)CBFβsgRNA,Cas9的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)Hep G2細(xì)胞,嘌呤霉素篩選基因敲除細(xì)胞,構(gòu)建細(xì)胞系。infusion cloning方法構(gòu)建CBFβ表達(dá)載體,Hep G2細(xì)胞提取RNA,反轉(zhuǎn)成c DNA,設(shè)計(jì)CBFβ引物擴(kuò)增目的基因,連接,轉(zhuǎn)化,挑取陽(yáng)性克隆,PCR鑒定,酶切鑒定,測(cè)序進(jìn)一步鑒定。獲得了穩(wěn)定敲除CBFβ的Hep G2細(xì)胞系及在Hep G2細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的CBFβ真核表達(dá)載體。為研究CBFβ基因在對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的調(diào)控及調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒
        1.1.2 試劑與引物
        1.1.3 儀器
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA的設(shè)計(jì)和寡核苷酸鏈合成
        1.2.2 構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體
        1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        1.2.4 篩選穩(wěn)定敲除CBFβ的Hep G2細(xì)胞株
        1.2.5 CBFβ基因的克隆
        1.2.6 RT-PCR鑒定
        1.2.7 Western blot鑒定
2 結(jié)果
    2.1 構(gòu)建CBFβ-sgRNA表達(dá)載體
    2.2 轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定敲除CBFβ細(xì)胞系
    2.3 構(gòu)建真核表達(dá)載體VR1012-HA-CBFβ
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