植物在生長發(fā)育過程中可能受到一定的生物脅迫與非生物脅迫。植物響應非生物脅迫時發(fā)生一系列生理生化反應,以適應不同的環(huán)境變化。DNMTs是植株DNA甲基化過程中重要的甲基轉移酶。目前關于植物體內DNA甲基過程中DNMT2的作用機制和功能性分析實驗研究較少,因此,研究DNMT2基因在植物生長發(fā)育過程中或植物抗逆性過程中的功能和作用,對提高作物抗性和品質具有重要意義。本文以模式植物番茄(Solanum lycopersicum)為實驗材料,通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對獲得11種物種中DNMT2蛋白的氨基酸序列,然后通過DNMAN軟件進行蛋白質保守域的分析,發(fā)現(xiàn)這些氨基酸序列具有相對比較保守的蛋白結構域。對這11種蛋白質氨基酸序列進行進化樹分析和DNA甲基化結構域分析,結果表明番茄SlDNMT2蛋白與馬鈴薯St DNMT2蛋白的親緣關系較近,同源性高達95.54%。同時構建SlDNMT2的多個植物表達載體進行一系列生理生化分析。首先,構建表達綠色熒光蛋白的融合表達載體p ART27-SlDNMT2-e GFP觀察SlDNMT2蛋白的亞細胞定位情況,結果表明SlDNMT2蛋白定位于細胞核中。利用植物基因...

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 DNA甲基化
        1.1.1 植物DNA甲基化的概念
        1.1.2 DNA甲基化作用的關鍵酶—DNA甲基轉移酶
        1.1.3 DNA甲基化應用及其前景
    1.2 植物抗逆性研究
        1.2.1 生物脅迫與非生物脅迫
        1.2.2 植物抗逆性的研究進展與意義
    1.3 轉基因番茄的研究現(xiàn)狀
    1.4 RNA干擾技術在植物基因組學中的應用
        1.4.1 RNA干擾技術的概念
        1.4.2 RNA干擾技術要點及其應用
    1.5 農桿菌介導法及其在基因工程中的應用
        1.5.1 農桿菌介導的轉化機理
        1.5.2 農桿菌介導法影響因素
        1.5.3 農桿菌介導法應用前景
    1.6 植物組培及其在基因組學中的應用
        1.6.1 植物組培的概念
        1.6.2 植物組培的關鍵要素及其應用前景
    1.7 植物蛋白亞細胞定位及其在基因工程中的應用
        1.7.1 亞細胞定位的概念和機理
        1.7.2 亞細胞定位的應用前景
    1.8 本實驗研究相關內容
第二章 實驗材料與方法
    2.1 材料與儀器設備
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與質粒
        2.1.3 相關引物信息
    2.2 實驗中主要儀器設備
        2.2.1 本實驗中主要儀器
        2.2.2 實驗器皿
    2.3 實驗相關試劑
        2.3.1 本實驗中涉及的相關酶
        2.3.2 本實驗中涉及的相關化學試劑
    2.4 本實驗中常用的試劑耗材
    2.5 相關試劑和培養(yǎng)基的配制
        2.5.1 分子實驗中相關培養(yǎng)基的配制
        2.5.2 分子實驗中相關試劑的配制
        2.5.3 植物組織培養(yǎng)中常用試劑的配制
        2.5.4 植物組織培養(yǎng)中相關植物激素的配制
        2.5.5 植物組織培養(yǎng)中相關培養(yǎng)基的配制
        2.5.6 瞬時表達系統(tǒng)相關試劑的配置
    2.6 相關引物設計
        2.6.1 引物設計原則
        2.6.2 引物設計基本步驟
    2.7 植株總RNA提取
    2.8 反轉錄獲得cDNA
        2.8.1 反轉錄反應體系
        2.8.2 逆轉錄PCR擴增程序
    2.9 SlDNMT2 擴增
        2.9.1 SlDNMT2 PCR反應體系
        2.9.2 SlDNMT2 PCR反應程序
    2.10 番茄RNAi表達載體的構建
        2.10.1 特異性片段siRNA1的克隆
            2.10.1.5 實驗步驟
        2.10.2 si RNA1與p SK載體的酶切、連接
        2.10.3 特異性片段siRNA1陽性鑒定
        2.10.4 特異性片段siRNA2克隆
        2.10.5 特異性片段siRNA2陽性鑒定
        2.10.6 p SK-si RNA重組質粒鑒定
        2.10.7 p SK-si RNA質粒快提檢測
        2.10.8 重組質粒的發(fā)夾結構的驗證
        2.10.9 重組質粒的切膠回收
        2.10.10 SlDNMT2-si RNA與 p BI121 連接
    2.11 SlDNMT2 亞細胞定位
        2.11.1 融合表達載體構建
        2.11.2 煙草瞬時表達
    2.12 SlDNMT2 組織特異性表達分析
    2.13 番茄植株的遺傳轉化
        2.13.1 大腸桿菌DH5α的制備
        2.13.2 制備農桿菌感受態(tài)(CaCl2法)
        2.13.3 PCR產物或酶切產物純化
        2.13.4 SlDNMT2 與中間載體連接
        2.13.5 連接產物轉化大腸桿菌
        2.13.6 菌落PCR鑒定
        2.13.7 SlDNMT2 酶切鑒定
        2.13.8 SlDNMT2 測序和序列分析
        2.13.9 p BI121-SlDNMT2-si RNA轉化農桿菌
        2.13.10 農桿菌單克隆陽性鑒定
    2.14 植物組織培養(yǎng)實驗
        2.14.1 發(fā)種子
        2.14.2 預培養(yǎng)
        2.14.3 農桿菌侵染與共培養(yǎng)
        2.14.4 篩選培養(yǎng)
        2.14.5 生根培養(yǎng)
    2.15 煉苗與移栽
    2.16 DNA水平的陽性鑒定
    2.17 RNA水平的陽性鑒定
        2.17.1 定量PCR組分
        2.17.2 定量PCR反應程序
        2.17.3 實驗步驟
    2.18 非生物脅迫下的表型分析
        2.18.1 鮮重分析
        2.18.2 植株高度分析
        2.18.3 植株側根數(shù)分析
        2.18.4 氣孔數(shù)分析
第三章 實驗結果與分析
    3.1 SlDNMT2 生物信息學分析
    3.2 SlDNMT2 基因c DNA序列克隆
    3.3 SlDNMT2 表達模式分析
    3.4 SlDNMT2 亞細胞定位分析
    3.5 SlDNMT2 特異性片段si RNA克隆
    3.6 siRNA1特異性序列陽性鑒定
    3.7 siRNA2特異性序列陽性鑒定
    3.8 發(fā)夾結構的驗證
    3.9 SlDNMT2 RNAi表達載體正確性檢測
    3.10 預培養(yǎng)
    3.11 共培養(yǎng)
    3.12 K60篩選培養(yǎng)
    3.13 K65篩選培養(yǎng)
    3.14 K70篩選培養(yǎng)
    3.15 生根培養(yǎng)
    3.16 轉基因植株DNA水平的陽性鑒定
    3.17 轉基因植株RNA水平的定量分析
    3.18 鹽脅迫條件下的表型分析
    3.19 甘露醇脅迫條件下的表型分析
    3.20 二價重金屬離子脅迫時的表型分析
    3.21 干旱環(huán)境下轉基因植物的表型分析
    3.22 轉基因植物葉片中氣孔情況的分析
    3.23 番茄中Sl TINY1、Sl SAG1 基因半定量分析
第四章 結果與討論
    4.1 實驗結論
    4.2 展望與討論
參考文獻
攻讀碩士學位期間的學術活動及成果情況



本文編號：3783090