采用RT-PCR方法從黑曲霉中克隆得到β-甘露聚糖酶基因（manA）cDNA,按照畢赤酵母密碼子優(yōu)化序列后,構建至畢赤酵母表達載體pPIC9K的EcoR I和Not I酶切位點之間,并與醇氧化酶強啟動子序列和α因子分泌肽信號序列融合。構建好的載體進行大腸桿菌轉化,提取大量質粒并用Sac I線性化后進行畢赤酵母轉化,篩選鑒定獲得酵母轉化子。重組菌接種到YPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)24 h后,經甲醇誘導,取發(fā)酵上清液經SDS-PAGE檢測到預期分子量大小的目標蛋白帶,β-甘露聚糖酶最高酶活為125.78 IU/mL,酶的比活力為188.86 IU/mg。結果表明β-甘露聚糖酶基因已在畢赤酵母中成功表達并能有效分泌到細胞外。 

【文章頁數】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 質粒、菌株、培養(yǎng)基、酶和主要試劑
    1.2 試驗方法
        1.2.1 黑曲霉β-甘露聚糖酶克隆
        1.2.2 重組表達載體的構建
        1.2.3 重組表達載體LiAc法轉入畢赤酵母
        1.2.4 畢赤酵母轉化子的PCR鑒定與活性篩選
        1.2.5 重組畢赤酵母的誘導表達、分離純化與SDS-PAGE電泳
            1) 誘導表達:
            2) 分離純化與SDS-PAGE電泳:
        1.2.6 重組β-甘露聚糖酶畢赤酵母工程菌酶活檢測
2 結果與分析
    2.1 黑曲霉β-甘露聚糖酶基因的克隆及檢測
    2.2 酵母重組表達載體pPIC9K/α-manA的構建與鑒定
    2.3 陽性克隆PCR與篩選結果
    2.4 β-甘露聚糖酶基因的在工程菌中的表達
        2.4.1 重組酶蛋白的SDS-PAGE檢測
        2.4.2 重組表達菌株酶活檢測
    2.5 討 論
3 結 論


【參考文獻】：
期刊論文
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[4]微生物β-甘露聚糖酶的研究進展[J]. 張建新,宋宜樂,馮軍廠,常緒路.  中國釀造. 2019(04)
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博士論文
[1]細菌來源新型低溫耐鹽甘露聚糖酶的研究[D]. 張蕊.云南師范大學 2018
[2]一種耐高溫β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中高效表達及其耐高溫機理分析[D]. 羅長財.江南大學 2018

碩士論文
[1]嗜熱菌來源新型β-甘露聚糖酶基因異源表達及飼用價值初探[D]. 嚴琳.西南民族大學 2019
[2]黑曲霉固態(tài)發(fā)酵制備β-甘露聚糖酶及其分離純化[D]. 張曉燕.南京林業(yè)大學 2014
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本文編號：3721615