結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）仍然是全球最成功的致病菌之一。結(jié)核病難以治療的癥結(jié)在于結(jié)核菌的持留性、耐藥性和毒力性,其中耐藥性結(jié)核分枝桿菌是治療的重難點(diǎn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì),2019年由吡嗪酰胺（Pyrazinamide）和氟喹諾酮類（Fluoroquinolone）耐藥結(jié)核菌引起的新發(fā)結(jié)核病例至少為630萬(wàn)例,而其中多耐藥病例為49萬(wàn)例。此外,由于多耐藥（MDR）和廣耐藥（XDR）結(jié)核病的發(fā)病率越來(lái)越高,可用于治療結(jié)核病的抗生素越來(lái)越少。為了更有效治愈結(jié)核病患者,必須開(kāi)發(fā)新的治療方案。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜是結(jié)核菌抵抗抗生素和宿主免疫殺菌的重要屏障。分枝桿菌細(xì)胞膜是一種復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu),主要由5個(gè)重要部分組成:質(zhì)膜（Plasma Membrane,PM）、肽聚糖（Peptidoglycan,PG）、阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan,AG）、外膜（Outer membrane,OM）和分枝菌酸（Mycolic Acid,MA）。細(xì)胞壁則主要由肽聚糖（PG）組成。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜在支持細(xì)胞生長(zhǎng),發(fā)揮細(xì)胞毒力和逃避宿主免疫等方面至關(guān)重要。... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
縮略語(yǔ)表
摘要
ABSTRACT
第1章 綜述
    1 結(jié)核菌與抗生素耐藥
    2 分枝桿菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的重要性
    3 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)概述
        3.1 細(xì)胞被膜生物合成膜結(jié)合蛋白的空間定位
        3.2 其他參與膜結(jié)合的蛋白
        3.3 脂肪酸合成
    4 分枝桿菌細(xì)胞壁組成
        4.1 肽聚糖
        4.2 阿拉伯半乳聚糖生物合成
        4.3 分枝菌酸
    5 分枝桿菌細(xì)胞壁靶點(diǎn)
        5.1 細(xì)菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo):磷酸化信號(hào)分子
        5.2 分枝桿菌STPKs和磷酸酶
        5.3 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和磷酸酶
        5.4 雙組分信號(hào)系統(tǒng)
    討論
    參考文獻(xiàn)
第2章 緒論
    1 研究目的、選題依據(jù)與意義
    2 科學(xué)問(wèn)題
    3 研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線
第3章 吡嗪酰胺耐藥基因的篩選和機(jī)制研究
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 質(zhì)粒與菌株
        1.2 主要試劑
        1.3 主要溶液及試劑
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 感受態(tài)的制備
        2.2 吡嗪酰胺敏感菌株篩選
        2.3 質(zhì)粒拯救法確定突變菌株轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)
        2.4 提取RNA及分析基因轉(zhuǎn)錄
        2.5 構(gòu)建回補(bǔ)菌株
        2.6 電轉(zhuǎn)恥垢分枝桿菌感受態(tài)
        2.7 Western-Blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)
        2.8 饑餓脅迫實(shí)驗(yàn)
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 吡嗪酰胺敏感突變體M492的分離與鑒定
        3.2 M492突變株對(duì)抗生素的敏感不是由于生長(zhǎng)差異引起的
        3.3 M492 突變株是恥垢分枝桿菌MSMEG_3314 缺失株
        3.4 突變株M492的基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        3.5 MSMEG_3314 基因與結(jié)核分枝桿菌EmrB同源性高
        3.6 MSMEG_3314基因缺失可引起氟喹諾酮類藥物的殺傷力增強(qiáng)
        3.7 MSMEG_3314基因參與抵抗過(guò)氧化氫的殺傷性
        3.8 添加硫脲或2,2′-聯(lián)吡啶可以抵消或減輕莫西沙星的殺傷力
        3.9 MSMEG_3314基因的缺失與細(xì)胞膜通透性改變有關(guān)但沒(méi)有改變細(xì)胞壁厚度
        3.10 MSMEG_3314基因缺失增大恥垢分枝桿菌細(xì)胞膜電位差
        3.11 RT-PCR發(fā)現(xiàn)乙醛酸循環(huán)與M492的PZA敏感有關(guān)
        3.12 M492突變株的乙醛酸循環(huán)速率降低
    4 討論
    參考文獻(xiàn)
第4章 羧酸酯酶CAEA通過(guò)分解細(xì)胞壁D-ALA-D-ALA導(dǎo)致萬(wàn)古霉素耐受
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 質(zhì)粒與菌株
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 主要溶液及試劑
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 同源重組法敲除恥垢分枝桿菌MSMEG_4296基因
        2.2 體外擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌Rv2224c基因片段
        2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
        2.4 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.5 大腸桿菌的熱激法轉(zhuǎn)化
        2.6 TA連接Rv2224c基因片段
        2.7 菌液鑒定PCR
        2.8 提取T-Rv2224c重組質(zhì)粒
        2.9 構(gòu)建pALACE-Rv2224c重組質(zhì)粒
        2.10 制備恥垢分枝桿菌感受態(tài)細(xì)胞
        2.11 Western Blot驗(yàn)證Rv2224c在恥垢分枝桿菌中的重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        2.12 蛋白純化
        2.13 測(cè)定生長(zhǎng)曲線
        2.14 滑動(dòng)實(shí)驗(yàn)和菌落形態(tài)觀察
        2.15 重組恥垢分枝桿菌在不同脅迫下的生存能力分析
        2.16 抑菌圈法測(cè)定重組恥垢分枝桿菌在SDS和H2O2壓力下的抑菌圈直徑
        2.17 測(cè)定重組恥垢分枝桿菌在聯(lián)胺條件下的CFU
        2.18 測(cè)定重組恥垢分枝桿菌在酸性條件下的CFU
        2.19 重組恥垢分枝桿菌耐藥性分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 Rv2224c基因功能域分析
        3.2 Rv2224c保守性分析
        3.3 恥垢分枝桿菌中MSMEG_4296敲除菌株質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.4 ΔMSMEG_4296 缺失菌株的篩選和鑒定
        3.5 ΔMSMEG_4296 回補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        3.6 MSMEG_4296敲除不影響生長(zhǎng)
        3.7 MSMEG_4296敲除改變分枝桿菌菌落形態(tài)
        3.8 MSMEG_4296敲除增強(qiáng)了恥垢分枝桿菌的滑動(dòng)能力
        3.9 MSMEG_4296敲除減弱了恥垢分枝桿菌生物膜的形成
        3.10 MSMEG_4296敲除能增強(qiáng)萬(wàn)古霉素對(duì)恥垢分枝桿菌的殺菌能力
        3.11 Rv2224c過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁通透性
        3.12 MSMEG_4296敲除能減弱恥垢分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活
    討論
    參考文獻(xiàn)
第5章 銅離子對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐受莫西沙星等抗生素至關(guān)重要
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 質(zhì)粒與菌株
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 主要試劑和溶液
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 培養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)菌株
        2.2 MIC測(cè)定
        2.3 抗生素CFU檢測(cè)
        2.4 恥垢分枝桿菌突變體庫(kù)的構(gòu)建
        2.5 測(cè)定細(xì)菌胞內(nèi)NADH濃度
        2.6 測(cè)定細(xì)菌胞內(nèi)銅離子濃度
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1構(gòu)建突變體庫(kù),篩選獲得在高銅濃度下耐受的突變體X674
        3.2 MSMEG_4702敲除后減弱了恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)
        3.3 添加銅離子能恢復(fù)MSMEG_4702敲除菌株的生長(zhǎng)
        3.4 添加銅離子能恢復(fù)MSMEG_4702敲除菌株的生長(zhǎng)
        3.5 MSMEG_4702敲除菌株細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度下降
        3.6 恥垢分枝桿菌單菌落形態(tài)隨胞內(nèi)銅離子濃度而改變
        3.7 MSMEG_4702負(fù)責(zé)銅離子的攝入而不是其它金屬離子
        3.8 敲除 MSMEG_4702增加對(duì)鐵硫簇合成的保護(hù)作用
        3.9 MSMEG_4702的敲除增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對(duì)莫西沙星的耐受
        3.10 MSMEG_4702的敲除增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中恥垢分枝桿菌的生存
    討論
    參考文獻(xiàn)
博士期間的學(xué)術(shù)成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Plant peroxisomal solute transporter proteins[J]. Lennart Charton,Anastasija Plett,Nicole Linka.  Journal of Integrative Plant Biology. 2019(07)



本文編號(hào)：3715542