本論文通過Sanger測序方法檢驗肝癌細胞系HepG2和HuH7中PTEN基因突變情況。結果顯示,HepG2細胞中包含野生型PTEN基因序列,HuH7細胞中檢測到PTEN基因發(fā)生突變,因此選擇肝癌細胞系HepG2用于后續(xù)實驗。利用Western Blotting檢測肝癌細胞HepG2中PTEN蛋白和肝癌腫瘤標志物甲胎蛋白AFP的表達水平,結果顯示兩者的蛋白表達量呈負相關性。NGF是最早開始研究也是研究最清楚的神經營養(yǎng)因子,近年來實驗研究表明,NGF參與到腫瘤生長、分化、血管形成以及轉移的過程中,在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。為了進一步探索NGF在肝癌細胞中的機制機理,本研究利用NGF處理野生型肝癌細胞HepG2和PTEN基因敲除的HepG2細胞,檢測細胞增殖、凋亡以及周期變化。結果顯示,NGF能夠有效抑制野生型HepG2細胞的增殖,促進其凋亡并同時誘導細胞內G0/G1周期阻滯,對于PTEN基因敲除的HepG2細胞,NGF對其增殖、凋亡和周期沒有顯著性作用。為了進一步探索肝癌細胞中PTEN蛋白和AFP蛋白的負相關作用,使用EGF、ATRA和NGF分別處理HepG2細胞,qRT-PC... 

【文章頁數】：84 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 緒論
    1.1 引言
    1.2 肝癌
        1.2.1 肝癌致病因素
            1.2.1.1 肝炎病毒與肝癌
            1.2.1.2 代謝與肝癌
        1.2.2 肝癌信號通路
            1.2.2.1 YAP
            1.2.2.2 PI3K/Akt/mT0R
            1.2.2.3 ANXA3/JNK
            1.2.2.4 NANOG
        1.2.3 HCC診斷中的肝癌標志物
            1.2.3.1 甲胎蛋白異質體3
            1.2.3.2 鱗狀細胞癌抗原
            1.2.3.3 脫-γ-羧基凝血酶原
            1.2.3.4 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3
            1.2.3.5 高爾基體糖蛋白73
            1.2.3.6 血管內皮生長因子
        1.2.4 HCC肝癌治療相關靶點
            1.2.4.1 抗體療法
            1.2.4.2 遺傳學治療
            1.2.4.3 HCSC小生態(tài)環(huán)境靶向治療
            1.2.4.4 分子靶向治療
        1.2.5 肝癌治療
            1.2.5.1 肝切除術
            1.2.5.2 肝移植
            1.2.5.3 介入治療
            1.2.5.4 消融治療
            1.2.5.5 放射治療
            1.2.5.6 系統(tǒng)化療
            1.2.5.7 靶向治療
            1.2.5.8 免疫治療和基因治療
            1.2.5.9 中醫(yī)治療
    1.3 抑癌基因PTEN基因及PI3K/Akt信號通路
        1.3.1 抑癌基因PTEN基因
        1.3.2 PI3K/Akt信號通路
    1.4 CRISPR/Cas基因編輯
        1.4.1 ZFNs技術
        1.4.2 TALENs技術
        1.4.3 CRISPR/Cas技術
    1.5 本研究的主要內容和意義
        1.5.1 研究主要內容
        1.5.2 研究意義
        1.5.3 設計路線
2 NGF抑制HepG2細胞增殖促進其凋亡
    2.1 前言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗細胞系
        2.2.2 實驗試劑
        2.2.3 實驗溶液
    2.3 實驗設備
    2.4 實驗設計
        2.4.1 細胞培養(yǎng)
        2.4.2 細胞傳代
        2.4.3 WST-1細胞增殖檢測
            2.4.3.1 WST-1細胞增殖檢測原理
            2.4.3.2 WST-1細胞增殖檢測實驗步驟
        2.4.4 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測
            2.4.4.1 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測原理
            2.4.4.2 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測實驗步驟
        2.4.5 細胞周期檢測實驗步驟
        2.4.6 CRISPR/Cas9基因編輯敲除PTEN基因
    2.5 實驗結果
        2.5.1 細胞增殖
        2.5.2 細胞凋亡
        2.5.3 細胞周期
    2.6 小結
3 Cas9蛋白的表達與純化
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 菌種及質粒
        3.2.2 實驗試劑
        3.2.3 實驗溶液
    3.3 實驗儀器
    3.4 實驗設計
        3.4.1 大腸桿菌BL-21(DE3)感受態(tài)的制備
        3.4.2 質粒轉化宿主菌株
        3.4.3 Cas9蛋白誘導表達
        3.4.4 表達產物蛋白分析
        3.4.5 誘導表達條件優(yōu)化
        3.4.6 過表達蛋白
        3.4.7 鎳柱親和純化
        3.4.8 透析
        3.4.9 超濾濃縮
    3.5 實驗結果
    3.6 小結
4 肝癌細胞HepG2中PTEN基因作用以及信號通路
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 實驗細胞系
        4.2.2 實驗試劑
        4.2.3 主要溶液
    4.3 實驗設備
    4.4 實驗設計
        4.4.1 Western Blotting檢測蛋白表達水平
        4.4.2 RNA提取
        4.4.3 快速反轉錄合成第一鏈cDNA
        4.4.4 SYBR Green熒光定量預混試劑qRT-PCR
    4.5 實驗結果
        4.5.1 肝癌細胞序列比對
        4.5.2 EGF處理HepG2細胞
        4.5.3 全反式維甲酸ATRA處理細胞
        4.5.4 NGF處理HepG2細胞
        4.5.5 Akt抑制劑處理細胞
        4.5.6 CRISPR/Cas9敲除PTEN基因
        4.5.7 細胞通路
    4.6 小結
5 結論與展望
    5.1 結論
    5.2 展望
參考文獻
附錄
致謝
作者和導師簡介
附件


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]Hepatitis B virus,HBx mutants and their role in hepatocellular carcinoma[J]. Ashraf Ali,Hany Abdel-Hafiz,Mohd Suhail,Amany Al-Mars,Mohammad Khalid Zakaria,Kaneez Fatima,Sultan Ahmad,Esam Azhar,Adeel Chaudhary,Ishtiaq Qadri.  World Journal of Gastroenterology. 2014(30)
[4]神經生長因子及其受體與腫瘤相關性研究進展[J]. 何學元,張有成.  國際消化病雜志. 2010(04)



本文編號：3688457