肌肉生長抑制素（myostatin,Mstn）基因失活可引起哺乳動物的肌肉增生,但其調控機制尚不清楚,且缺乏可靠的試驗材料驗證Mstn相關分子通路的變化。本研究所用PK3108細胞系是在野生型PK15細胞系的基礎上成功靶向敲除一條等位基因,在其靶位點敲入標記基因,敲除了204bp的外顯子3序列,LoxP錨定在其標記基因兩側。利用Cre/LoxP重組酶刪除系統(tǒng)刪除插入PK3108Mstn靶位點的標記,借助流式細胞儀和熒光蛋白甄別得到無標記的過渡型細胞系PK3108-2。將Cas9/sgRNA表達載體和供體DNA共轉染PK3108-2,借助G418抗性篩選和倒置熒光顯微鏡挑選出僅帶陽性標記的克隆L18,對其基因組進行PCR產(chǎn)物凝膠電泳與PCR產(chǎn)物測序,證明克隆L18在預設位點發(fā)生同源重組;對其蛋白質進行Western印跡實驗表明,Mstn被成功地敲除失活。綜上結果證明,本研究實現(xiàn)了雙等位基因的精準敲除,構建了Mstn雙敲除梯度回復表達細胞系。本研究為揭示Mstn的作用機制提供理想的實驗材料,也為雙等位基因的敲除提供了可借鑒的技術路線。 

【文章頁數(shù)】：8 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 Cas9/sgRNA表達載體和供體DNA的構建
    1.3 PK3108-2和L18細胞系的構建
    1.4 PCR引物設計及反應條件
        1.4.1 PCR引物設計
        1.4.2 PCR條件
    1.5 Western印跡
2 結果
    2.1 Cas9/sgRNA和p Turbo-Cre及供體DNA載體的鑒定
    2.2 L18發(fā)生同源重組基因組左右結合部序列分析
    2.3 PK3108-2與L18的熒光標記鑒定
    2.4 Mstn不同基因型的凝膠電泳及Western印跡
3 討論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9介導的同源重組技術構建豬肌抑素基因敲除細胞系[J]. 綦世金,華再東,劉西梅,華文君,鄭新民,陳祥,李太山,陳建武,李奎,唐中林,畢延震,陳彬.  中國生物化學與分子生物學報. 2016(10)
[2]Cre-LoxP重組系統(tǒng)刪除內源性選擇標記基因的效能評價[J]. 王志蕊,劉西梅,周荊榮,鄭新民,魏慶信,董發(fā)明,畢延震.  中國生物化學與分子生物學報. 2014(02)
[3]肌肉生長抑制素（MSTN）的研究進展[J]. 耿紅紅,王政.  畜牧與飼料科學. 2012(09)
[4]水通道蛋白5基因敲除純合子小鼠的獲取[J]. 王桂芳,董春玲,肖奎,孫加源,陳智鴻,白春學.  第二軍醫(yī)大學學報. 2007(11)



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