睪丸間質細胞（Leydig Cell,LC）是雄性個體雄激素的主要來源,雄激素對男性生殖系統(tǒng)的發(fā)育及男性生殖功能的維持具有決定性作用。DNA甲基化是核酸表觀遺傳修飾的主要表現(xiàn)方式之一,能在轉錄水平上調控靶標基因的表達。到目前為止,尚未有研究在表觀遺傳方面對LC雄激素合成通路關鍵酶的表達及對雄激素分泌調控方面進行報道。本研究首先分離不同發(fā)育階段的睪丸間質祖細胞（PLC）、睪丸間質未成熟細胞（ILC）以及睪丸間質成熟細胞（ALC）,同時以大鼠尾部成纖維細胞（TTF）作為對照,利用轉錄組測序RNA-seq技術和基因組甲基化測序RRBS技術相結合的方法,分析不同發(fā)育階段LC細胞轉錄水平的變化和基因組DNA甲基化圖譜差異,探索在LC發(fā)育過程中基因組DNA甲基化對雄激素合成通路關鍵酶基因表達的表觀遺傳調控機制,為了解LC譜系發(fā)育過程、雄激素合成調控機制及日后利用成體細胞重編程為具有功能的類睪丸間質細胞提供科學依據(jù)。本研究的主要結果如下:1、對不同發(fā)育階段的LC（PLC、ILC、ALC）及TTF 8個樣本（2個重復）進行轉錄組測序,最終平均各樣本獲得6.60Gb數(shù)據(jù)。共檢測出15852個基因在LC中... 

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 睪丸間質細胞的功能及發(fā)育分化
        1.1.1 LC分類和功能
        1.1.2 LC類固醇生成途徑
        1.1.3 LC的分化調控和類固醇生成調節(jié)
    1.2 成纖維細胞研究簡介
    1.3 DNA甲基化研究簡介
        1.3.1 DNA甲基化調控機制及作用
        1.3.2 DNA甲基化檢測方法
    1.4 轉錄組學研究簡介
    1.5 研究內容、目的及意義
第二章 PLC、ILC、ALC及 TTF的轉錄組分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實驗用具與耗材
        2.1.4 實驗儀器
        2.1.5 溶液配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 雄性SD大鼠原代PLC、ILC、ALC分離
        2.2.2 雄性SD大鼠TTF分離
        2.2.3 總RNA提取
        2.2.4 總RNA質量檢測
        2.2.5 RNA-seq文庫構建
        2.2.6 RNA-seq文庫質檢與上機測序
    2.3 生物信息學分析方法
        2.3.1 測序數(shù)據(jù)質控分析
        2.3.2 差異表達基因分析
        2.3.3 差異表達基因GO功能注釋和富集分析
        2.3.4 差異表達基因KEGG pathway富集分析
    2.4 結果與分析
        2.4.1 總RNA質量檢測
        2.4.2 RNA-seq堿基質量值
        2.4.3 RNA-seq堿基含量分布
        2.4.4 RNA-seq數(shù)據(jù)隨機性檢驗
        2.4.5 RNA-seq數(shù)據(jù)飽和度檢驗
        2.4.6 Unique mapped reads在參考基因組上的分布
        2.4.7 RNA-seq數(shù)據(jù)產(chǎn)出及與參考基因組比對分析
        2.4.8 不同發(fā)育階段LC(PLC、ILC、ALC)差異表達基因的分析
        2.4.9 PLC、ILC、ALC與 TTF的差異表達基因分析
        2.4.10 LC各發(fā)育階段(PLC、ILC、ALC)差異表達基因GO和 KEGG pathway富集分析
        2.4.11 PLC、ILC、ALC與 TTF的差異表達基因GO和 KEGG Pathway富集分析
第三章 PLC、ILC、ALC及 TTF的簡化甲基化圖譜分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 實驗耗材
        3.1.4 主要試劑
        3.1.6 溶液配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 雄性SD大鼠原代PLC、ILC、ALC分離
        3.2.2 雄性SD大鼠TTF分離
        3.2.3 基因組DNA提取及質量檢測
        3.2.4 RRBS文庫構建
        3.2.5 RRBS文庫質檢與上機測序
    3.3 生物信息學分析方法
        3.3.1 RRBS數(shù)據(jù)質控分析
        3.3.2 RRBS數(shù)據(jù)與參考基因組比對分析
        3.3.3 甲基化位點檢測
        3.3.4 區(qū)域甲基化水平分析
        3.3.5 差異甲基化區(qū)域(DMR)鑒定與分析
        3.3.6 差異甲基化基因(DCG)分析
    3.4 結果與分析
        3.4.1 基因組DNA質量檢測
        3.4.2 RRBS堿基質量分布
        3.4.3 RRBS堿基類型分布
        3.4.4 RRBS數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
        3.4.5 RRBS測序深度分布統(tǒng)計
        3.4.6 CG、CHG及 CHH不同類型的甲基化位點分析
        3.4.7 基因不同功能元件甲基化水平
        3.4.8 DMR數(shù)目分析
        3.4.9 DMR在基因不同功能元件上的分布情況
        3.4.10 DMR在不同染色體上的分布情況
        3.4.11 差異甲基化基因(DCG)鑒定
第四章 PLC、ILC、ALC及 TTF全基因組甲基化與轉錄組聯(lián)合分析
    4.1 實驗方法
        4.1.1 DMR-mRNA相關性分析
        4.1.2 差異甲基化且差異表達基因GO和 KEGG pathway富集分析
    4.2 結果與分析
        4.2.1 LC各發(fā)育階段甲基化組與轉錄組聯(lián)合分析
        4.2.2 LC與 TTF甲基化組與轉錄組聯(lián)合分析
第五章 討論
    5.1 PLC、ILC、ALC的差異表達候選基因分析
    5.2 PLC、ILC、ALC與 TTF的差異表達候選基因分析
    5.3 DNA甲基化介導的差異表達候選基因分析
    5.4 Promoter區(qū)域甲基化介導的差異表達候選基因分析
第六章 結論、創(chuàng)新點與展望
    6.1 結論
    6.2 主要創(chuàng)新點
    6.3 展望
參考文獻
附錄
英文縮略詞表
致謝



本文編號：3667555