基因重組是可用于基因克隆、基因修飾的一種分子生物學技術,操作簡單而高效,對于基因表征的研究具有重要的價值和意義。本論文主要研究谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的基因敲除和重組工程介導的點突變。谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032及其衍生菌株是工業(yè)上用于生產氨基酸的重要生產菌株。染色體基因敲除的研究將有助于研究基因表征和蛋白質功能。為克服目前的方法效率低的問題,探索比較各系統(tǒng)的敲除效率,以期建立一個適用于谷氨酸棒狀桿菌的高效簡便基因編輯方法。首先,通過調節(jié)I-SceI基因之前的核糖體結合位點獲得更高水平的基因表達。盡管打靶DNA片段通過重組工程成功替代了抗性基因,但第二步抗性基因的去除未能通過短同源臂介導的重組而實現(xiàn)。將同源臂延伸至1 kb后,由自殺載體介導的基因敲除成功實現(xiàn)了無痕敲除。高敲除效率顯示了此法具有作為有效基因敲除策略的強大潛力。通過構建Cre誘導型表達載體和crtI2基因缺失載體,初步測試了另一種基因敲除系統(tǒng)——Cre/loxP介導的基因敲除系統(tǒng)。最后,構建了 IPTG誘導的recT-cas9基因表達載體,將用于單鏈DNA輔助的CRISPR/Cas9介導的染色體基因編輯。本... 

【文章來源】：南京師范大學江蘇省 211工程院校

【文章頁數】：79 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?Ｗ１菌體Ｒｅｄ介導的同源重組過程??人噬菌體Ｒｅｄ介導的同源重組過程［４］（圖１）

植物細胞中的遺傳操作。Ａｌｂｅｒｔ等［３９］報道了一系列可被識別重組的突變／ｏｘＰ位??點，為Ｃｒｅ／／ｏｘＰ系統(tǒng)的廣泛應用提供了保證。??利用Ｃｒｅ／ｆｃｘＰ系統(tǒng)進行基因敲除的一般方法如圖２所示??ｐ＃遙粒矗歟??ｐＣＲＡ４ｌ９??Ｕ?ｉａｃＺ??［＞Ｃ?ＬＥ?ｍｕｔｍｔ?ｋｉｘＴｉ?ＲＦ；?ｎｍｉｔｍｉ?�。恚叮�?＞＜］???ｉ?ｉ?？／＿??Ｇｅｎｏｒｎｇ??ＧＲ１?１＾．???????｜＾｜?ＧＲ２??Ｔａｒｇｅｔ?ｒｅｇｉｃｅｉｆ?１０?－?５６?ｋｂ）??——Ｃ＝＾＜］［＾ｒ｜Ｊ＝＝］???Ｖ???????Ｊ??Ｈ．?ｃｏｌｉ?＾??ｅ＇ｉ?＾?Ｃｒｅ?ｒｃｅ＾ｓｉ＇ｓｂｉｎ＾ｓｃ－ｍｅｄｉａｉｅｄ?ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ??ｋ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ???１????Ｃｏｒｙ?Ｗｏｒｍ?ｆ．，??圖２?Ｃｒｅ／ｔｏｃＰ介導的谷氨酸棒狀桿菌大片段敲除示意圖??為卡那霉素抗性基因；辦ｒ為大觀霉素抗性基因；ｂｃＺ為半乳糖酶編碼基因；ＧＲ１和??ＧＲ２為ＰＣＲ擴增獲得的谷氨酸棒狀桿菌短片段基因并通過重組整合入質粒中。黑色箭頭（Ｐ１??和Ｐ２）為ＰＣＲ引物??在構建三個不同抗性的質粒后，轉入Ｃｒｅ表達質粒，即將／ｏｘＰ位點插入目??的基因片段的兩端，并驗證兩／ｏｘＰ位點為同方向；完成重組后，設法去除質粒??或留在菌體內。但利用Ｃｒｅ／／〇ｘＰ系統(tǒng)完成一次敲除后，基因組上會殘留一個／ｏｘＰ??位點而影響后續(xù)實驗操作，不利于在同一菌株中進行二次敲除。后來發(fā)現(xiàn)了多種??變異丨ｏｘ位點

圖３?ＣＲＩＳＰＲ的位點結構??ＣＲＩＳＰＲ由一系列短的高度保守的正向重復序列（ｒｅｐｅａｔｓ）與長度相似的間隔??序列（ｓｐａｃｅｒｓ）間隔排列組成，如圖３所示。存在于ＣＲＩＳＰＲ位點附近一系列??ＣＲＩＳＰＲ?相關基因（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｇｅｎｅｓ，?Ｃａｓ?ｇｅｎｅｓ），是?ＣＲＩＳＰＲ?免疫防御途??徑中的基本組成成分，往往與ＣＲＩＳＰＲ位點的重復序列相連。ｃｍ基因是一類較??大的多態(tài)性基因家族，編碼的蛋白質具有與核酸相關的功能域以及與核酸酶、聚??合酶、解旋酶等結合的活性，Ｃａｓ蛋白通過位點特異性的切割將入侵ＤＮＡ切斷。??不同的基因在宿主應對外源ＤＮＡ入侵時發(fā)揮著不同的作用；且在不同的物??種中，ｏｗ基因的種類也各不相同，表達出多種同源但功能不相關的Ｃａｓ蛋白［５１１??ＣＲＩＳＰＲ位點的第一個重復序列上游是ＣＲＩＳＰＲ前導序列（Ｌｅａｄｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ），啟動??ＣＲＩＳＰＲ序列的轉錄［５２］，轉錄產生的非編碼ＲＮＡ被命名為ＣＲＩＳＰＲ?ＲＮＡｓ??（ｃｒＲＮＡｓ）［５３］

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3594146