表達禽流感病毒HA基因重組鴨病毒性腸炎病毒誘導特異性快速免疫保護機制的研究
本文關(guān)鍵詞:表達禽流感病毒HA基因重組鴨病毒性腸炎病毒誘導特異性快速免疫保護機制的研究,,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
【摘要】:H5N1亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正粘病毒科有囊膜多形態(tài)單股負鏈RNA病毒。該病毒嚴重威脅養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展和人類健康。AIV通過結(jié)構(gòu)蛋白識別宿主細胞表面受體并與受體結(jié)合感染細胞,其中HA蛋白作為最重要的保護性抗原,已成為各類抗流感疫苗研究的靶蛋白。前期研究中,本實驗室已成功構(gòu)建表達H5N1亞型禽流感病毒HA基因重組鴨病毒性腸炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)rDEVus78Ha株,免疫鴨后可在鴨體內(nèi)誘導產(chǎn)生對同源AIV堅固且快速的免疫保護,但其免疫機制仍不清楚。在高致病性禽流感病毒(HPAIV)感染宿主細胞的過程中,HA蛋白的信號肽和跨膜區(qū)對其活性和表達都存在影響。為研究抗原不同遞呈形式對疫苗保護效果的影響,本試驗首先利用RedE/T同源重組技術(shù)和Gateway LR克隆技術(shù),將以SV40作為啟動子的不同形式的HA基因編碼序列插入DEV復制非必須區(qū)US7和US8之間,隨后分別構(gòu)建了表達缺失HA基因信號肽的重組DEV(rDEV-PK)和缺失HA基因跨膜區(qū)的重組DEV(rDEV-PSM);重組病毒拯救成功后,分別以rDEVus78Ha、rDEV-PK和rDEV-PSM對三周齡SPF鴨進行免疫,于免疫后3d和7d進行攻毒實驗,對重組病毒rDEV-PK和rDEV-PSM的免疫保護能力進行評估。為研究rDEVus78Ha能夠提供特異性快速免疫保護的機制,用其免疫三周齡SPF鴨,同時設(shè)置禽流感滅活疫苗Re-5株和PBS對照組,于免疫后1d、3d、5d、7d、14d分別采集脾臟、法氏囊、氣管洗液、唾液和淚液,分離外周血淋巴細胞、脾臟淋巴細胞和血清,然后利用熒光定量PCR、流式細胞檢測和間接ELISA等技術(shù)對重組DEV免疫后鴨體內(nèi)的天然免疫和獲得性免疫情況進行研究。試驗結(jié)果表明:成功拯救了兩株重組病毒rDEV-PK和rDEV-PSM,缺失HA基因信號肽的rDEV-PK表達的HA蛋白不能正常地轉(zhuǎn)移到細胞膜上而在感染細胞內(nèi)積聚,缺失HA基因跨膜區(qū)的重組rDEV-PSM表達的HA蛋白被分泌到細胞外,且HA基因信號肽或跨膜區(qū)的缺失均不影響重組病毒的復制;但重組病毒rDEV-PK和rDEV-PSM并不能誘導鴨產(chǎn)生對同源性HPAIV的特異性快速免疫保護作用;包含HA蛋白完整信號肽和跨膜區(qū)序列的重組病毒rDEVus78HA株免疫鴨后能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)細胞因子IFN-γ、Granzyme-A的表達,增強淋巴細胞刺激增殖能力,誘導產(chǎn)生更多的CD4+T細胞,提高了機體細胞免疫應答的能力。本研究表明,HA蛋白的信號肽和跨膜區(qū)均是誘導機體產(chǎn)生特異性快速免疫應答的必須區(qū)域;而增強的細胞免疫應答可能是rDEVus78Ha能夠誘導機體產(chǎn)生特異性快速免疫保護的關(guān)鍵因素。這為特異性快速免疫機制的研究和未來快速免疫疫苗的研究提供了參考和研究基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】:高致病性禽流感 重組鴨病毒性腸炎病毒 HA蛋白 熒光定量PCR 細胞因子
【學位授予單位】:甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2016
【分類號】:S852.65
【目錄】:
- 摘要3-5
- Summary5-11
- 第一章緒論11-20
- 1.禽流感病毒概述12-17
- 1.1 流感病毒分子生物學研究進展12-13
- 1.2 H5N1亞型禽流感13-14
- 1.3 HA蛋白14-15
- 1.4 HA蛋白的信號肽與跨膜區(qū)15-16
- 1.5 禽流感病毒疫苗研究進展16-17
- 2.鴨病毒性腸炎病毒概述17-20
- 2.1 鴨病毒性腸炎病毒研究進展17-18
- 2.2 鴨病毒性腸炎病毒載體研究進展18-20
- 第二章表達H5亞型禽流感病毒不同形式HA基因重組鴨病毒性腸炎病毒的構(gòu)建與鑒定20-38
- 1.材料與方法20-30
- 1.1 病毒株、重組質(zhì)粒及細胞20
- 1.2 試劑與耗材20-21
- 1.3 主要儀器21-22
- 1.4 試驗動物22
- 1.5 引物的設(shè)計合成22
- 1.6 表達缺失信號肽或跨膜區(qū)AIV HA基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建22-25
- 1.7 重組粘粒T-us78HApk和T-us78HApsm的構(gòu)建25
- 1.8 重組病毒的拯救25-28
- 1.9 重組病毒的鑒定28-29
- 1.10 重組病毒一步生長曲線的測定29
- 1.11 重組病毒的攻毒保護效力評估29-30
- 2.結(jié)果30-36
- 2.1 不同區(qū)域HA基因的擴增及重組質(zhì)粒的鑒定30-31
- 2.2 重組病毒的成功拯救31-32
- 2.3 重組病毒的PCR鑒定32
- 2.4 重組病毒的IFA鑒定32-33
- 2.5 重組病毒的Western blot鑒定33-34
- 2.6 重組病毒的生長動力學曲線34
- 2.7 重組病毒的攻毒保護效力評估34-36
- 3.討論36-38
- 第三章禽流感重組鴨病毒性腸炎病毒載體活疫苗在鴨體內(nèi)誘導天然免疫情況研究38-51
- 1.材料與方法38-44
- 1.1 疫苗38
- 1.2 主要試劑38
- 1.3 主要儀器設(shè)備38-39
- 1.4 試驗動物39
- 1.5 試驗設(shè)計39
- 1.6 引物設(shè)計39
- 1.7 組織總RNA提取39-41
- 1.8 反轉(zhuǎn)錄41-42
- 1.9 質(zhì)粒標準品的制備42-43
- 1.10 質(zhì)粒標準品濃度的測定及拷貝數(shù)的計算43
- 1.11 熒光定量PCR43-44
- 1.12 標準品標準曲線的繪制44
- 1.13 方法性能評估44
- 1.14 細胞因子的表達定量44
- 2.結(jié)果44-48
- 2.1 標準曲線的繪制44-46
- 2.2 性能評估46-47
- 2.3 細胞因子mRNA表達定量47-48
- 3.討論48-51
- 第四章禽流感重組鴨病毒性腸炎病毒載體活疫苗在鴨體內(nèi)誘導獲得性免疫情況研究51-56
- 1.材料與方法51-52
- 1.1 疫苗及動物51
- 1.2 主要試劑51-52
- 1.3 主要儀器設(shè)備52
- 1.4 方法52
- 2 結(jié)果52-55
- 2.1 淋巴細胞刺激增殖指數(shù)(SI)測定結(jié)果52-53
- 2.2 CD~(4+)淋巴細胞測定結(jié)果53-54
- 2.3 間接ELISA檢測HA特異性抗體結(jié)果54-55
- 3.討論55-56
- 第五章全文結(jié)論56-57
- 參考文獻57-65
- 致謝65-66
- 作者簡介66-67
- 導師簡介67-68
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本文編號:358437
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