天麻是一種名貴的中藥材,屬于一種真菌營養(yǎng)型蘭科植物,能鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥眩暈、鎮(zhèn)痛、改善記憶、治療老年癡呆,還能夠提高免疫力。天麻主要藥用活性成分為天麻素和對羥基苯甲醇,藥用天麻兩者總含量不能低于0.25%。天麻中活性成分的合成與細胞色素P450相關,而細胞色素P450還原酶（CPR）是細胞色素P450酶系（CYPs）中重要的組成成分,為CYPs提供電子。蜜環(huán)菌是天麻生長過程中最重要的大型共生真菌,侵入到天麻體內的蜜環(huán)菌將被天麻消化轉化為營養(yǎng)物質供給自己生長,蜜環(huán)菌的生長影響到天麻產量和品質。蜜環(huán)菌主要靠降解菌材中的木質纖維素為葡萄糖等小分子有機物供蜜環(huán)菌生長需要。蜜環(huán)菌利用菌材能力與蜜環(huán)菌分泌漆酶活性有關。目前,天麻是藥食同源植物,市場需求量大,主要靠人工栽培天麻滿足市場需求。然而,人工栽培天麻功能活性成分含量和利用菌材效率比較低。因此,本研究利用生物工程技術,首先建立蜜環(huán)菌轉基因技術,然后通過蜜環(huán)菌天麻轉錄組測序,基于轉錄組數據,篩選天麻細胞色素P450還原酶基因（GeCPR）和蜜環(huán)菌漆酶基因（Lac）,找出他們CDS序列,通過RACE-PCR技術擴增出這些基因全長序列,構建Lac基... 

【文章來源】：昆明理工大學云南省

【文章頁數】：104 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

真核表達載體pHGWL7-mRFP1的構建流程

昆明理工大學碩士學位論文20門載體pENTR-2B分別使用BamH1和Xho1進行雙酶切，通過熱激轉化法進行連接。提取pENTR-MRFP1質粒，與植物表達載體pHGWL7通過Gateway技術進行連接，獲得植物表達載體pHGWL7-mRFP1。然后以pHGWL7-mRFP1的質粒為模板進行PCR反應，獲得一條750bp左右的條帶（圖2.2），再用BamH1和Xho1雙酶切該質粒，能獲得750bp左右的條帶（圖2.3），說明真核表達載體pHGWL7-mRFP1構建成功。圖2.2PCR檢測mRFP1基因Figure2.1PCRdetectionofmRFP1gene圖2.3pHGWL7-mRFP1重組質粒BamHI和XhoI雙酶切Figure2.3DoubledigestionofBamHIandXhoIbyrecombinantplasmidpHGWL7-mRFP1M：DL5000DNAMarker；1：pMD18-mRFP1重組質粒；2：pENTR-mRFP1重組質粒；3-4:pHGWL7-mRFP1重組質粒BamHI和XhoI雙酶切。750bp

昆明理工大學碩士學位論文20門載體pENTR-2B分別使用BamH1和Xho1進行雙酶切，通過熱激轉化法進行連接。提取pENTR-MRFP1質粒，與植物表達載體pHGWL7通過Gateway技術進行連接，獲得植物表達載體pHGWL7-mRFP1。然后以pHGWL7-mRFP1的質粒為模板進行PCR反應，獲得一條750bp左右的條帶（圖2.2），再用BamH1和Xho1雙酶切該質粒，能獲得750bp左右的條帶（圖2.3），說明真核表達載體pHGWL7-mRFP1構建成功。圖2.2PCR檢測mRFP1基因Figure2.1PCRdetectionofmRFP1gene圖2.3pHGWL7-mRFP1重組質粒BamHI和XhoI雙酶切Figure2.3DoubledigestionofBamHIandXhoIbyrecombinantplasmidpHGWL7-mRFP1M：DL5000DNAMarker；1：pMD18-mRFP1重組質粒；2：pENTR-mRFP1重組質粒；3-4:pHGWL7-mRFP1重組質粒BamHI和XhoI雙酶切。750bp

【參考文獻】：
期刊論文
[1]小麥細胞色素P450基因克隆及其序列研究[J]. 高璇.  生物化工. 2018(05)
[2]不同栽培模式對昭通烏天麻產量及品質的影響[J]. 桑正林,楊順強,趙啟君,武婷.  河南農業(yè)科學. 2018(08)
[3]基于細胞色素P450單加氧酶介導的4-甲酚氧化降解途徑的天麻素生物合成[J]. 鐘貝芬,杜磊,李眾,張偉,張興旺,李菁,黃淑蘭,胡翔,李盛英,劉琨.  湖南師范大學自然科學學報. 2018(04)
[4]微生物細胞色素P450酶及其對異源物質的代謝研究進展[J]. 丁俊美,李國濤,黃遵錫.  應用與環(huán)境生物學報. 2018(03)
[5]云芝NADPH-細胞色素P450還原酶在大腸桿菌中表達及酶學特性分析[J]. 孫雪娃,何超,方澤民,肖亞中.  生物工程學報. 2018(07)
[6]天麻研究新進展[J]. 韓大榮.  中國處方藥. 2018(04)
[7]漆酶及其應用研究進展[J]. 王馥麗,趙鵬,裴承新,黃啟斌,蔣輝,習海玲.  生命科學儀器. 2017(05)
[8]昭通天麻產業(yè)發(fā)展中菌材的探析[J]. 馬勛靜,田治蛟,戴堃,李德朗,顧盼,田孟華,周明月,楊菊.  園藝與種苗. 2017(08)
[9]漆酶可降解底物種類的研究進展[J]. 張澤雄,劉紅艷,邢賀,馬鈺.  生物技術通報. 2017(10)
[10]豬苓與天麻共生蜜環(huán)菌類群的比較[J]. 門金鑫,邢曉科,郭順星.  菌物學報. 2017(08)

博士論文
[1]中國蜜環(huán)菌的遺傳學與系統(tǒng)學研究[D]. 秦國夫.中國林業(yè)科學研究院 2002

碩士論文
[1]天麻林下仿野生種植部分關鍵技術的研究[D]. 李振斌.成都中醫(yī)藥大學 2016
[2]固定化漆酶用于廢水深度處理的研究[D]. 劉影.齊魯工業(yè)大學 2015



本文編號：3573279