轉(zhuǎn)vp28基因藍藻抗WSSV重組疫苗的穩(wěn)定性和安全性
發(fā)布時間:2022-01-01 01:30
白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是一種引起對蝦爆發(fā)性死亡的病毒,因其傳播速度快、宿主范圍廣、致死率高等特點,已成為對蝦養(yǎng)殖業(yè)嚴重病害之一。目前全球已研制出多種藥物,如各種重組疫苗(DNA疫苗、RNA疫苗和蛋白亞單位疫苗)等,在實驗室水平均有成效。然而,至今尚未見可在養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模應(yīng)用。我們研究集體已根據(jù)WSSV主要囊膜蛋白VP28在防治WSSV中的重要作用,用藍藻這一原核表達系統(tǒng)表達VP28蛋白,經(jīng)實驗驗證可有效免疫對蝦蝦苗;谖覀冄芯考w十幾年來的研究進展,本學位研究著重關(guān)注這種重組疫苗產(chǎn)業(yè)化過程中產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性,得到以下主要結(jié)果:(1)針對本疫苗在中試生產(chǎn)中發(fā)生目的基因丟失的情況,對重組載體質(zhì)粒(攜帶目的基因)的穩(wěn)定性作了分析。關(guān)鍵重組載體質(zhì)粒pRL-489-vp28和pGM-T-WSSV-vp28在轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10后,通過不同抗生素壓力篩選得到保持良好穩(wěn)定性條件。發(fā)現(xiàn)前者超過10 h,后者超過7 h后,質(zhì)粒損失率均迅速大于10%。培養(yǎng)10-16個小時后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌液OD600值可達1.2-2.8之間,有效細菌平均卻只在6...
【文章來源】:上海海洋大學上海市
【文章頁數(shù)】:67 頁
【學位級別】:碩士
【部分圖文】:
WSSV(中國大陸株)基因組基本結(jié)構(gòu)
上海海洋大學碩士學位論文一個月,重組疫苗樣品便開始發(fā)黃、出現(xiàn)白色霉菌并有腥臭味(圖 3-1 C);在 4 ℃低溫冰箱中存放的樣品雖然放置 5 個月時還沒有發(fā)出異味,但是會在四個月左右出現(xiàn)白色霉菌(圖 3-1 B),且邊緣有藍色液體滲出(圖 3-1 D),疑似為藻粉中藻藍蛋白從細胞里滲出。-80℃和-20℃條件下儲存的樣品變化差異不明顯,樣品表面仍為綠色的藻體本身顏色(圖 3-1 A),但是否兩者之間有具體的變化、差異,需進行更為細致的分子檢測和生物學活性檢測。
圖 3-3 RT-qPCR 檢測標準曲線Fig.3-3 RT-qPCR detection standard curve預(yù)實驗發(fā)現(xiàn),由于重組疫苗本身的蛋白質(zhì)特性,樣品在 4℃處理條件下連月取樣中,超過2個月即無法提取完整RNA作為RT-qPCR檢測樣本模板得到其檢測結(jié)果。同理,30℃儲存的樣品在一個月以上時就開始發(fā)黃產(chǎn)生甚至變黏使其無法提取 RNA。因此在后續(xù)檢測中,連續(xù)三批重組疫苗取第 1-3 批樣品中,-80℃取樣均為儲存 6 個月的樣品(簡記為 A1、A2、A3),取樣均為儲存 6 個月的樣品(簡記為 B1、B2、B3),4℃取樣均為儲存 樣品(簡記為 C1、C2、C3),30℃取樣均為儲存 1 個月的樣品(簡記為D2、D3)。 3-5 是連續(xù)三批重組疫苗在不同儲存溫度下的 RT-qPCR 實驗結(jié)果,圖 3-電泳圖(引物大小 184bp)。綜合圖 3-4 和表 3-5 實驗結(jié)果可以看出,樣品℃儲存 6 個月后仍具有良好的基因表達率,即 vp28 基因沒有丟失。-20℃、 30℃中儲存重組疫苗,即使儲存時間短,也有部分樣品中 vp28 基因丟失。The logarithm of the copy numberM A1 B1 C1 A2 B2 C2 A3 B3 C3
【參考文獻】:
期刊論文
[1]細胞樣Western Blot分析技術(shù)探討[J]. 湯加勇,趙華. 實驗科學與技術(shù). 2017(06)
[2]萊茵衣藻“細菌型”pepc2基因葉綠體表達及其對油脂蛋白質(zhì)含量的影響[J]. 馮思豫,施定基,賈曉會,朱嘉誠,米華玲,賈睿,何培民. 上海海洋大學學報. 2017(05)
[3]凍融法和超聲破碎法提取螺旋藻中藻藍蛋白的工藝研究[J]. 侯兆乾,劉鑫陽,史超,段開紅,田瑞華. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版). 2017(02)
[4]轉(zhuǎn)vp28藍藻口服劑對凡納濱對蝦抗白斑綜合征病毒能力及免疫反應(yīng)的影響[J]. 郭媛媛,殷嶸,施定基,周園,何培民,吳倩萍,莊旻敏,韋章良,賈睿. 水產(chǎn)學報. 2017(09)
[5]人類寄生蟲重組疫苗研究進展[J]. 張忠佩,秦元華,任一鑫,余鋼銀,戴曉冬,鄭莉莉,張雪強,崔昱. 中國病原生物學雜志. 2017(05)
[6]不同途徑感染白斑綜合征病毒(WSSV)對日本沼蝦的致病性[J]. 殷嶸,郭媛媛,韋章良,施定基,何培民,賈睿. 生物工程學報. 2017(06)
[7]白斑綜合征病毒(WSSV)基因VP28原核表達與檢測[J]. 張正陽,張春莉,施定基,賈曉會,賈睿,何培民. 上海海洋大學學報. 2017(02)
[8]VP28-CecropinD融合蛋白抗對蝦白斑綜合征病毒效果的研究[J]. 王詩怡,夏晨陽,懷浩,胡捷,孟明翔. 科技展望. 2016(36)
[9]原核表達重組質(zhì)粒pUC57-CTP-PTEN的構(gòu)建及鑒定[J]. 喻備,黃媛,胡海峰,汪自力,楊進. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學. 2017(04)
[10]反復(fù)凍融法對枸杞多糖溶出率的研究[J]. 溫梓辰,榮雪,郭乃菲,陳點點,王慧妍,胡丹,劉廣斌. 安徽農(nóng)業(yè)科學. 2016(19)
博士論文
[1]腫瘤治療型抗體藥物的研發(fā)[D]. 唐喆偉.華東師范大學 2013
[2]對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)膜蛋白VP12和VP150的功能研究以及病毒極早期基因RNA干擾的初步研究[D]. 李建波.廈門大學 2013
[3]乙型腦炎病毒分子流行病學、診斷及重組疫苗研究[D]. 劉昊.吉林大學 2013
[4]雞痘病毒282E4株基因組和蛋白質(zhì)組解析、載體構(gòu)建與HIV重組疫苗研究[D]. 劉存霞.吉林大學 2013
[5]櫛孔扇貝(Chlamys farreri)組織凝集活性分析及一種C-型凝集素單克隆抗體的研制和特性研究[D]. 談艷苗.中國海洋大學 2013
[6]蛋白質(zhì)組學和代謝組學技術(shù)篩選顱腦損傷促進骨折愈合的關(guān)鍵分子[D]. 楊樹廣.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院 2012
[7]抗WSSV口服VP28亞單位疫苗研究及促克氏螯蝦生長口服DNA藥物研究[D]. 張毅.武漢大學 2011
[8]中國對蝦“黃海2號”對WSSV的抗病性分析[D]. 孟憲紅.中國海洋大學 2010
[9]水稻谷蛋白的質(zhì)譜和Western Blot鑒定與貯藏蛋白分析[D]. 何瑩.武漢大學 2010
[10]轉(zhuǎn)基因作物生物安全性評價與監(jiān)管體系的分析與對策[D]. 王琴芳.中國農(nóng)業(yè)科學院 2008
碩士論文
[1]低磷脅迫大豆RT-qPCR內(nèi)參基因的篩選及谷胱丙肽合成代謝酶的表達[D]. 陳玉連.廣西大學 2017
[2]vp28基因在集胞藻中的克隆表達及轉(zhuǎn)基因工程藻的純化[D]. 朱嘉誠.上海海洋大學 2017
[3]基于高豐度轉(zhuǎn)錄本的細菌RT-qPCR檢測技術(shù)及其應(yīng)用[D]. 王新輝.吉林大學 2016
[4]對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)基因原核表達與檢測[D]. 張正陽.上海海洋大學 2016
[5]九種殺藻劑和三種復(fù)配殺藻劑對銅綠微囊藻、小球藻和水綿生長的影響[D]. 高偉.河南師范大學 2016
[6]對蝦WSSV和IHHNV病毒重組酶聚合酶擴增(RPA)快速檢測方法的研究[D]. 夏小明.上海海洋大學 2015
[7]廣西凡納濱對蝦白斑綜合征病毒的檢測及結(jié)構(gòu)蛋白VP24和VP51的克隆與表達[D]. 彭亞.廣西大學 2015
[8]肉食動物細小病毒重組疫苗研究[D]. 楊洋.吉林大學 2013
[9]中國大陸幾株WSSV毒株毒力測定及分析[D]. 劉飛.中國海洋大學 2013
[10]對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)VP12、VP14、VP51、VP136C與病毒及宿主蛋白的相互作用[D]. 馬方方.上海海洋大學 2013
本文編號:3561386
【文章來源】:上海海洋大學上海市
【文章頁數(shù)】:67 頁
【學位級別】:碩士
【部分圖文】:
WSSV(中國大陸株)基因組基本結(jié)構(gòu)
上海海洋大學碩士學位論文一個月,重組疫苗樣品便開始發(fā)黃、出現(xiàn)白色霉菌并有腥臭味(圖 3-1 C);在 4 ℃低溫冰箱中存放的樣品雖然放置 5 個月時還沒有發(fā)出異味,但是會在四個月左右出現(xiàn)白色霉菌(圖 3-1 B),且邊緣有藍色液體滲出(圖 3-1 D),疑似為藻粉中藻藍蛋白從細胞里滲出。-80℃和-20℃條件下儲存的樣品變化差異不明顯,樣品表面仍為綠色的藻體本身顏色(圖 3-1 A),但是否兩者之間有具體的變化、差異,需進行更為細致的分子檢測和生物學活性檢測。
圖 3-3 RT-qPCR 檢測標準曲線Fig.3-3 RT-qPCR detection standard curve預(yù)實驗發(fā)現(xiàn),由于重組疫苗本身的蛋白質(zhì)特性,樣品在 4℃處理條件下連月取樣中,超過2個月即無法提取完整RNA作為RT-qPCR檢測樣本模板得到其檢測結(jié)果。同理,30℃儲存的樣品在一個月以上時就開始發(fā)黃產(chǎn)生甚至變黏使其無法提取 RNA。因此在后續(xù)檢測中,連續(xù)三批重組疫苗取第 1-3 批樣品中,-80℃取樣均為儲存 6 個月的樣品(簡記為 A1、A2、A3),取樣均為儲存 6 個月的樣品(簡記為 B1、B2、B3),4℃取樣均為儲存 樣品(簡記為 C1、C2、C3),30℃取樣均為儲存 1 個月的樣品(簡記為D2、D3)。 3-5 是連續(xù)三批重組疫苗在不同儲存溫度下的 RT-qPCR 實驗結(jié)果,圖 3-電泳圖(引物大小 184bp)。綜合圖 3-4 和表 3-5 實驗結(jié)果可以看出,樣品℃儲存 6 個月后仍具有良好的基因表達率,即 vp28 基因沒有丟失。-20℃、 30℃中儲存重組疫苗,即使儲存時間短,也有部分樣品中 vp28 基因丟失。The logarithm of the copy numberM A1 B1 C1 A2 B2 C2 A3 B3 C3
【參考文獻】:
期刊論文
[1]細胞樣Western Blot分析技術(shù)探討[J]. 湯加勇,趙華. 實驗科學與技術(shù). 2017(06)
[2]萊茵衣藻“細菌型”pepc2基因葉綠體表達及其對油脂蛋白質(zhì)含量的影響[J]. 馮思豫,施定基,賈曉會,朱嘉誠,米華玲,賈睿,何培民. 上海海洋大學學報. 2017(05)
[3]凍融法和超聲破碎法提取螺旋藻中藻藍蛋白的工藝研究[J]. 侯兆乾,劉鑫陽,史超,段開紅,田瑞華. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版). 2017(02)
[4]轉(zhuǎn)vp28藍藻口服劑對凡納濱對蝦抗白斑綜合征病毒能力及免疫反應(yīng)的影響[J]. 郭媛媛,殷嶸,施定基,周園,何培民,吳倩萍,莊旻敏,韋章良,賈睿. 水產(chǎn)學報. 2017(09)
[5]人類寄生蟲重組疫苗研究進展[J]. 張忠佩,秦元華,任一鑫,余鋼銀,戴曉冬,鄭莉莉,張雪強,崔昱. 中國病原生物學雜志. 2017(05)
[6]不同途徑感染白斑綜合征病毒(WSSV)對日本沼蝦的致病性[J]. 殷嶸,郭媛媛,韋章良,施定基,何培民,賈睿. 生物工程學報. 2017(06)
[7]白斑綜合征病毒(WSSV)基因VP28原核表達與檢測[J]. 張正陽,張春莉,施定基,賈曉會,賈睿,何培民. 上海海洋大學學報. 2017(02)
[8]VP28-CecropinD融合蛋白抗對蝦白斑綜合征病毒效果的研究[J]. 王詩怡,夏晨陽,懷浩,胡捷,孟明翔. 科技展望. 2016(36)
[9]原核表達重組質(zhì)粒pUC57-CTP-PTEN的構(gòu)建及鑒定[J]. 喻備,黃媛,胡海峰,汪自力,楊進. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學. 2017(04)
[10]反復(fù)凍融法對枸杞多糖溶出率的研究[J]. 溫梓辰,榮雪,郭乃菲,陳點點,王慧妍,胡丹,劉廣斌. 安徽農(nóng)業(yè)科學. 2016(19)
博士論文
[1]腫瘤治療型抗體藥物的研發(fā)[D]. 唐喆偉.華東師范大學 2013
[2]對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)膜蛋白VP12和VP150的功能研究以及病毒極早期基因RNA干擾的初步研究[D]. 李建波.廈門大學 2013
[3]乙型腦炎病毒分子流行病學、診斷及重組疫苗研究[D]. 劉昊.吉林大學 2013
[4]雞痘病毒282E4株基因組和蛋白質(zhì)組解析、載體構(gòu)建與HIV重組疫苗研究[D]. 劉存霞.吉林大學 2013
[5]櫛孔扇貝(Chlamys farreri)組織凝集活性分析及一種C-型凝集素單克隆抗體的研制和特性研究[D]. 談艷苗.中國海洋大學 2013
[6]蛋白質(zhì)組學和代謝組學技術(shù)篩選顱腦損傷促進骨折愈合的關(guān)鍵分子[D]. 楊樹廣.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院 2012
[7]抗WSSV口服VP28亞單位疫苗研究及促克氏螯蝦生長口服DNA藥物研究[D]. 張毅.武漢大學 2011
[8]中國對蝦“黃海2號”對WSSV的抗病性分析[D]. 孟憲紅.中國海洋大學 2010
[9]水稻谷蛋白的質(zhì)譜和Western Blot鑒定與貯藏蛋白分析[D]. 何瑩.武漢大學 2010
[10]轉(zhuǎn)基因作物生物安全性評價與監(jiān)管體系的分析與對策[D]. 王琴芳.中國農(nóng)業(yè)科學院 2008
碩士論文
[1]低磷脅迫大豆RT-qPCR內(nèi)參基因的篩選及谷胱丙肽合成代謝酶的表達[D]. 陳玉連.廣西大學 2017
[2]vp28基因在集胞藻中的克隆表達及轉(zhuǎn)基因工程藻的純化[D]. 朱嘉誠.上海海洋大學 2017
[3]基于高豐度轉(zhuǎn)錄本的細菌RT-qPCR檢測技術(shù)及其應(yīng)用[D]. 王新輝.吉林大學 2016
[4]對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)基因原核表達與檢測[D]. 張正陽.上海海洋大學 2016
[5]九種殺藻劑和三種復(fù)配殺藻劑對銅綠微囊藻、小球藻和水綿生長的影響[D]. 高偉.河南師范大學 2016
[6]對蝦WSSV和IHHNV病毒重組酶聚合酶擴增(RPA)快速檢測方法的研究[D]. 夏小明.上海海洋大學 2015
[7]廣西凡納濱對蝦白斑綜合征病毒的檢測及結(jié)構(gòu)蛋白VP24和VP51的克隆與表達[D]. 彭亞.廣西大學 2015
[8]肉食動物細小病毒重組疫苗研究[D]. 楊洋.吉林大學 2013
[9]中國大陸幾株WSSV毒株毒力測定及分析[D]. 劉飛.中國海洋大學 2013
[10]對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)VP12、VP14、VP51、VP136C與病毒及宿主蛋白的相互作用[D]. 馬方方.上海海洋大學 2013
本文編號:3561386
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