[目的]構(gòu)建針對(duì)人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子2（mitochondrial transcription termination factor 2,MTERF2）的shRNA干擾表達(dá)載體,檢測(cè)其對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞MTERF2基因表達(dá)的干擾效率。[方法]以人MTERF2基因?yàn)榘邢?設(shè)計(jì)并合成的2條互補(bǔ)寡核苷酸鏈克隆至pSilencer^TM4.1-CMV neo真核表達(dá)載體中得到重組干擾質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和DNA測(cè)序鑒定;運(yùn)用脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞;采用半定量RT-PCR檢測(cè)2個(gè)干擾質(zhì)粒對(duì)人MTERF2基因mRNA表達(dá)的干擾效果,并篩選最有效的shRNA干擾序列;采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)2個(gè)干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后MTERF2蛋白的表達(dá)情況。[結(jié)果]經(jīng)PCR鑒定和DNA測(cè)序鑒定證實(shí),pSi-MTERF2-1和pSi-MTERF2-2重組shRNA干擾表達(dá)質(zhì)粒中已插入目的 DNA片斷。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MTERF2-shRNA的HeLa細(xì)胞48 h后,pSi-MTERF2-1和pSi-MTERF2-2干擾表達(dá)質(zhì)粒均可以顯著地降低人MTERF2基因mRNA和... 

【文章來(lái)源】：生物技術(shù). 2017,27(05)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1.2 試劑
        1.1.3 儀器
        1.1.4 培養(yǎng)基
    1.2 方法
        1.2.1 人MTERF2基因靶向shRNA序列的設(shè)計(jì)與合成
        1.2.2 sh DNA片段與p SilencerTM4.1-CMV neo表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2.3 重組shRNA干擾表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        1.2.4 重組質(zhì)粒p Si-MTERF2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞
        1.2.5 半定量RT-PCR檢測(cè)人MTERF2基因mR-NA的表達(dá)
        1.2.6 Western Blot檢測(cè)人MTERF2蛋白的表達(dá)
        1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 MTERF2 sh DNA片段與p SilencerTM4.1-CMV neo質(zhì)粒連接及其鑒定
    2.2 半定量RT-PCR檢測(cè)人MTERF2基因mRNA的表達(dá)
    2.3 Western Blot檢測(cè)人MTERF2蛋白的表達(dá)
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子2在大腸桿菌表達(dá)及多克隆抗體的制備與鑒定[J]. 熊偉,孫美濤,梅雯,楊勇琴,自加吉,張曉娟,余敏.  生物技術(shù). 2017(03)
[2]人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子2（MTERF2）在Caski宮頸癌細(xì)胞的表達(dá)和定位[J]. 孫美濤,張成桂,梅雯,楊勇琴,楊澤芳,張曉娟,熊偉.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2017(06)
[3]線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族的表達(dá)以及在MPTP/MPP+誘導(dǎo)下的表達(dá)變化[J]. 張林冰,韓艷艷,仇石,許珊,左伋,劉雯.  解剖學(xué)報(bào). 2017(01)
[4]線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（mTERF）蛋白家族的研究進(jìn)展[J]. 黃淑顏,丘式浚,陳家逸,陳健璞,李曉云,李玲.  生命科學(xué)研究. 2016(05)
[5]人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子2基因啟動(dòng)子區(qū)的生物信息學(xué)分析[J]. 熊偉,張曉娟,孫美濤,張海洋,徐彤.  井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2016(01)
[6]線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族在線粒體基因表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用[J]. 熊偉,余敏,左紹遠(yuǎn).  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2015(03)
[7]線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族研究進(jìn)展[J]. 余敏,伍紅,譚德勇.  生命科學(xué). 2007(05)
[8]一個(gè)人類線粒體轉(zhuǎn)錄終止樣因子基因的克隆[J]. 陳瑤,何云剛,余敏,錢偉,譚德勇.  云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2003(S1)



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