熱激蛋白是生物遭到脅迫時產(chǎn)生的一類蛋白,除此之外,在生長發(fā)育中也具有非常重要的功能。熱激蛋白70（HSP70）是熱激蛋白家族中高度保守的一類,參與了高溫、干旱、鹽等多種非生物逆境脅迫。玉米作為重要的農(nóng)作物,經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)HSP70家族包括多個成員,絕大多數(shù)成員的功能還不清楚,本研究對ZmHSP70-4.1、ZmHSP70-12基因的的蛋白序列、亞細(xì)胞定位及探索及功能進(jìn)行了分析,最后通過互作蛋白的篩選及驗證為其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。通過生物信息學(xué)分析ZmHSP70-4.1、ZmHSP70-12的亞細(xì)胞定位及氨基酸序列基序分析,發(fā)現(xiàn)ZmHSP70-4.1、ZmHSP70-12蛋白與HSP70蛋白保守序列及結(jié)構(gòu)非常相似,生物信息學(xué)預(yù)測顯示二者分別定位在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng);構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體并瞬時轉(zhuǎn)化煙草,并在熒光共聚焦顯微鏡下觀察到ZmHSP70-4.1定位于細(xì)胞質(zhì)/核,ZmHSP70-12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果一致。構(gòu)建ZmHSP70-4.1超表達(dá)載體,獲得純合擬南芥超表達(dá)株系,通過皿中甘露醇及鹽處理下的移苗試驗發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株根長長于野生型,并且高鹽脅迫下,超表達(dá)植株存活率高于野生型;... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

HSP70結(jié)構(gòu)模型

P 的分子伴侶 HSP40(DnaJ)和核苷酸交換因子 NEF。HSP并與其結(jié)合從而防止其聚集，底物的結(jié)合和釋放通過 AT在這種情況下，底物與 HSP70 之間的相互作用由 HSP40HSP40s 還可以與未折疊的肽鏈直接相互作用并將蛋伴侶蛋白折疊的早期階段中，HSP40 在底物識別和遞送用。然后，J-結(jié)構(gòu)刺激 HSP70 的 ATP 酶活性，從而使 H作用(圖 2)。ATP 酶活性的刺激是通過與 J-結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含(HPD)的保守三肽的特異性相互作用實現(xiàn)的。HSP40 在細(xì) ER，以及細(xì)胞溶質(zhì)，這些部位的基因表達(dá)同時受 ER 應(yīng)

圖 3 ZmHSP70s 蛋白結(jié)構(gòu)及氨基酸序列分析Fig.3 ZmHSP70s proteins structure胞定位克隆及亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建證亞細(xì)胞定位預(yù)測的準(zhǔn)確性，根據(jù) ZmHSP70-4.1、ZmHSP70-異性引物，并在上下游加入了限制性酶切位點(diǎn)，由于目的基因的上游，所以在設(shè)計 ZmHSP70-4.1、ZmHSP70-12 下游引物時必 4a)。以 cDNA 為模板擴(kuò)增 ZmHSP70-4.1、ZmHSP70-12，利用PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(圖 4b)。將 ZmHSP70-4.1、ZmHSP70-12 與克隆載，將菌落 PCR 和雙酶切驗證正確的陽性克隆送測序。序正確的基因片段和 pSuper1300:GFP 載體連接，經(jīng)雙酶切驗-4.1-GFP，ZmHSP70-12-GFP 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建成功(圖 4c)。

【參考文獻(xiàn)】：
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