發(fā)布時間：2021-11-23 11:08

　　[目的]采用環(huán)介導恒溫擴增和解螺旋酶依賴的恒溫擴增方法建立丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）基因分型的方法。[方法]1.建立HCV的恒溫擴增反應體系�；诃h(huán)介導恒溫擴增（LAMP）的原理,針對丙型肝炎病毒HCV-1b,2a,3和6a基因型設計每種亞型的引物�；诮饴菪负銣財U增（HDA）的原理,設計一對通用引物以擴增HCV-1b,3a和3b,另設計一對通用引物擴增HCV-2a和6a,在兩個體系中分別設計各亞型的探針對HCV進行基因分型。2.依據(jù)HCV全基因的5,UTR～Core區(qū)中各基因型特異的基因序列,用Primer Explorer V.4軟件設計1 b,2a,3和6a型對應的引物用于LAMP擴增,優(yōu)化LAMP反應體系。設計HCV-1/3引物和2/6引物用于HDA擴增,每個體系設計對應型別Taqman探針用于基因分型。3.LAMP法擴增HCV的性能評價。將所設計的引物與對應的模板反應,確定所設計的HCV各基因型的引物特異性。對不同型別的陽性標本倍比稀釋,稀釋后的不同濃度的樣本平均分成10份分別提取RNA,加入對應的特異性的引物,以10個樣本全部檢測為陽性的最... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學云南省

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２：?ＬＡＭＰ體系中引物與對應的模板反應，ＮＣ表示去離子水作為模板的陰性??

圖２：?ＬＡＭＰ體系中引物與對應的模板反應，ＮＣ表示去離子水作為模板的陰性??對照。??１．２?ＬＡＭＰ體系的最佳反應溫度和時間。??１．２．１?ＬＡＭＰ擴增溫度的優(yōu)化??將ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ，３ａ，３ｂ和６ａ引物與對應的模板進行反應，分別將ＬＡＭＰ反應??溫度設為５８。０：，６３。０：，６５１：，反應６〇１１１丨１１。當溫度為６５°０時＾１０／－１１３，２３，３＆，３１），６３全??部為陽性（圖３），由此，后續(xù)實驗以６５°Ｃ為ＬＡＭＰ反應體系的最佳反應溫度。??ａＮＣ??

設置４０，５０，６０ｍｉｎ三個時間梯度分別對ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ，３，６ａ四種基因型模板和引??物進行檢測，結果顯示ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ反應管在４０ｍｉｎ下顯示較弱的陽性，５０，６０ｍｉｎ??后全為陽性（圖４－Ａ，Ｂ）；?ＨＣＶ－３，６ａ４０ｍｉｎ時為陰性，在５０，６０ｍｉｎ后全為陽性，??（圖４－Ｃ，Ｄ）。四個亞型在６０ｍｉｎ后反應管無為陽性反應，后續(xù)實驗中我們選擇??６０ｍｉｎ作為最佳反應時間。??ＨＣＶ－ｌｂ?ＨＣＶ－２ａ?ＨＣＶ－３?ＨＣＶ－６ａ??Ａ?Ｍ?４０?５０?６０?ＮＣ?４０?５０?６０?ｍｉｎ?＾?Ｍ?４０?５０?６０?ＮＣ＇?４０?５０?６０?ｍｉｎ??Ｂ棚ｎ??１?°。??Ｂ?Ｉ?ＩＣＹ－ｌｂ?ＴＩＣＶ－２ａ?Ｄ?ＨＣＶ－３?ＨＣＶ－６ａ??４０?５０?６０?４０?５０?６０?ｍｉｎ?ＮＣ?４０?５０?６０?４０?５０?６０?ｍｉｎ?ＮＣ??圖４．?ＬＡＭＰ體系的時間優(yōu)化。Ａ：ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ的ＬＡＭＰ反應產物的電泳圖，ＮＣ表??示陰性對照。Ｂ丄ＡＭＰ體系在４０ｍｉｎ，５０ｍｉｎ，６０ｍｉｎ條件下的ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ反應結果??圖。Ｃ．ＨＣＶ－３，６ａ的ＬＡＭＰ反應產物的電泳圖。Ｄ．ＨＣＶ－３，６ａ在ＬＡＭＰ反應下??４０ｍｉｎ，５０ｍｉｎ，６０ｍｉｎ?的結果圖。??２．?ＬＡＭＰ法的特異性評價??ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ，３，６ａ的引物只與對應的模板反應呈黃色，與其他模板反應為紅??色。同時，ＨＣＶ－３型的引物可以同時與模板ＨＣＶ－３ａ，３ｂ反應，反應管均為黃色。??ｔｅｍｐｌａｔｅ??Ａ?Ｉ?２?３?４?ＮＣ?１３?１?２?３?４?５?ＮＣ??；?——＂Ｔ

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3513756