CRISPR/Cas系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)于細菌,對入侵的病毒或噬菌體DNA具有免疫作用�；贑RISPR/Cas的免疫機制,設計開發(fā)的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)已經(jīng)成為真核生物基因編輯的主流工具,在擬南芥、水稻等高等植物的基因組功能研究中已經(jīng)廣泛應用。本研究以中國鵝掌楸纖維素合酶（Cellulose synthase,CESA）為研究對象,首次構建了具有表達中國鵝掌楸纖維素合酶（Cellulose synthase,CESA）gRNA（guide RNA）的CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng),以LcCESA1基因外顯子5’端的第一個外顯子區(qū)域的GN19NGG序列設計gRNA引物;以p201N-Cas9為載體,Gibson Assembly誖Master Mix為連接酶,通過Gibson Assembly連接技術,將CESA1-gRNA連入p201N-Cas9中,獲得p201N-Cas9-CESA1-gRNA載體。根據(jù)載體中插入序列,設計了兩對檢測引物,經(jīng)PCR鑒定,均獲得了相應大小的序列;測序分析進一步證實確認gRNA已經(jīng)完整準確地連入載體。p201N-Cas9-CESA1-gRNA載... 

【文章來源】：分子植物育種. 2017,15(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

重組質粒及其PCR檢測電泳分析

(hairpin)的部分堿基序列重疊。表1所用引物序列Table1Theprimersequences引物序列(5'-3')Primersequences(5'-3')TCAAGCGAACCAGTAGGCTTGAAACGAGTTCGTAATGATTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAATCATTACGAACTCGTTTCACATGCACCTAATTTCACTAGATGTGTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG引物名稱PrimernamegRNA-FgRNA-RUbi3p218(F)ISceIR(R)中國鵝掌楸纖維素合酶的CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)的gRNA表達載體構建ExpressionVectorConstructionofCelluloseSynthasegRNAWithCRISPR/Cas9GeneKnockoutSystemofL.chinense圖2p201N-Cas9-CESA1-gRNA載體結構Figure2p201N-Cas9-CESA1-gRNAcarrierstructure2197

Cas系統(tǒng)來進行基因組的定點編輯(Lietal.,2013;Nekrasovetal.,2013)。但CRISPR/Cas系統(tǒng)在鵝掌楸基因編輯中的應用暫時還未見報道。本研究利用克隆獲得中國鵝掌楸(Liriodendronchinense)纖維素合酶1(CESA1)基因序列，設計CESA1-gRNA,建立一步法獲得表達gRNA的p201N-Cas9載體，作為后期鵝掌楸纖維素合酶基因編輯研究的載體工具。1結果與分析1.1PCR檢測本試驗選取對1號單克隆菌液提取的重組質粒進行PCR擴增，用2組引物均可以擴增得到相應大小的片段，與預期的條帶大小一致，證實其為陽性重組子(圖1)。1.2測序基因編輯的效率與gRNA序列有關。將陽性菌液送樣測序，重復測序3次，證實插入的gRNA序列圖1重組質粒及其PCR檢測電泳分析注:M1:DL15000DNAmarker;M2:DL2000DNAmarker;1和2代表p201N-Cas9-CESA1-gRNA質粒;3和4分別代表引物1和引物2Figure1RecombinantplasmidanditsPCRdetectionelec-trophoresisanalysisNote:M1:DL15000DNAmarker;M2:DL2000DNAmarker;1and2representedp201N-Cas9-CESA1-gRNAplasmid;3and4representedprimer1andprimer22196

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]鵝掌楸紙漿林種源選擇與生長過程研究[D]. 駱羿.中南林業(yè)科技大學 2007



本文編號：3507183