大腸桿菌mazG基因參與mazEF介導(dǎo)的嚴(yán)緊反應(yīng)調(diào)控
發(fā)布時間：2021-11-02 01:49
目的探索mazG基因參與調(diào)控mazEF毒素-抗毒素系統(tǒng)（TAs）介導(dǎo)的細菌生長抑制與程序性死亡的分子機制,明確MazG蛋白真正的生理功能。方法以大腸桿菌MC4100為原型,通過relA基因的回復(fù)突變,獲得relA野生型的菌株MC4200。通過同源重組的方法,構(gòu)建大腸桿菌mazG、mazEF、mazEFG基因敲除菌株,測試mazG基因在不同基因背景菌株中過表達對細菌存活率的影響;通過rifampicin、H2O2及serine hydroxamate（SHT）等脅迫條件處理細菌,研究mazG及mazEFG操縱子缺失菌株的生長曲線與存活率;克隆大腸桿菌mazG基因,構(gòu)建誘導(dǎo)型過表達質(zhì)粒pET28a-mazG及突變體pET28a-mazG E38A,在BL21菌株中表達純化MazG蛋白,通過酶學(xué)實驗驗證了MazG蛋白的去磷酸酶活性;測試突變體過表達對細菌存活率的影響。結(jié)果 mazG過表達對大腸桿菌MC4200的生長無顯著影響,但對mazEFG基因敲除株具有顯著抑制作用;MazG的細胞毒性依賴于其NTP-PPase酶活性;mazEF的存在會顯著抑制m...
【文章來源】：國際藥學(xué)研究雜志. 2020,47(08)北大核心
【文章頁數(shù)】：9 頁
【部分圖文】：
不同物種來源MazG蛋白的序列比對注：VWQ04633.1：大腸桿菌；CNG39363.1：結(jié)核分枝桿菌；ACN47095.1：沙門氏菌；CYB76634.1：金黃色葡萄球菌
為探究基因maz EFG操縱子對細菌正常生長造成的影響，本文對大腸桿菌MC4100菌株進行了rel A基因的回復(fù)突變，構(gòu)建了MC4200菌株，使其獲得正常的嚴(yán)緊反應(yīng)能力。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了MC4200的maz EF、maz G、maz EFG基因敲除菌株，分別標(biāo)識為4200、4200△EF、4200△G和4200△EFG。文獻表明[10],maz G基因在大腸桿菌maz EFG敲除菌株中過表達會顯著抑制大腸桿菌的生長。為進一步探究maz G的細胞毒性與maz EF的關(guān)系及其對細菌生存率的影響，我們分別向MC4200和MC4200△EFG菌株轉(zhuǎn)入構(gòu)建好的p BAD33-maz G載體，將陽性轉(zhuǎn)化菌株分別命名為4200G和4200G△EFG。通過添加阿拉伯糖誘導(dǎo)Maz G蛋白的表達，觀察其對菌株生存率的影響。結(jié)果顯示4200G△EFG菌株過表達maz G時，其生長速度（G=1.757±0.001495,n=3）明顯低于未添加Arab的4200G△EFG菌株（P<0.01），該結(jié)果與文獻結(jié)果[10]吻合（圖1）。但引人注意的是，在4200G菌株過表達maz G時，生長速度（G=1.246±0.001633,n=3）則與未添加Arab時4200G菌株無明顯差異（圖1）。這說明maz G基因過表達時，顯著抑制了細胞的正常生長，且這種細胞毒性與maz EF密切相關(guān)。這一結(jié)果表明，maz EFG操縱子作為一個整體共同發(fā)揮作用，它們在調(diào)控細菌生長抑制與凋亡中具有協(xié)同效應(yīng)，maz EF基因?qū)az G可能具有負(fù)調(diào)控作用。2.2 Maz G的細胞毒性依賴于其d NTP焦磷酸水解酶活性
圖2 不同物種來源MazG蛋白的序列比對注：VWQ04633.1：大腸桿菌；CNG39363.1：結(jié)核分枝桿菌；ACN47095.1：沙門氏菌；CYB76634.1：金黃色葡萄球菌為排除極化效應(yīng)對實驗結(jié)果的影響，在MC4200、MC4200△maz G及MC4200△EFG菌株中轉(zhuǎn)入p BAD-maz G質(zhì)粒，對應(yīng)菌株標(biāo)記為MC4200G、MC4200G△maz G及MC4200G△maz EFG。通過加入Ara誘導(dǎo)maz G基因的表達以回補Maz G，比較回補菌株與野生型菌株在10μg/ml利福平刺激下的存活率。Western印跡法結(jié)果表明（圖8），阿拉伯糖的加入成功誘導(dǎo)了Maz G的表達（攜帶6*His標(biāo)簽，圖8B）。maz G基因回補后，MC4200菌株和MC4200△G菌株與野生型菌株無顯著差異，這說明maz G的敲除并未影響其上游maz EF的表達，未產(chǎn)生“極化效應(yīng)”。而MC4200△EFG在Maz G回補后，細菌存活率會顯著低于野生型菌株（P<0.01），這是由于maz G的活性所致，該結(jié)果與本文圖1結(jié)果及文獻[11]結(jié)果吻合。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]毒素-抗毒素系統(tǒng)及其典型模型研究進展[J]. 熊建偉,杜現(xiàn)禮,車永勝,陳依軍. 藥物生物技術(shù). 2017(05)
本文編號：3471107
【文章來源】：國際藥學(xué)研究雜志. 2020,47(08)北大核心
【文章頁數(shù)】：9 頁
【部分圖文】：
不同物種來源MazG蛋白的序列比對注：VWQ04633.1：大腸桿菌；CNG39363.1：結(jié)核分枝桿菌；ACN47095.1：沙門氏菌；CYB76634.1：金黃色葡萄球菌
為探究基因maz EFG操縱子對細菌正常生長造成的影響，本文對大腸桿菌MC4100菌株進行了rel A基因的回復(fù)突變，構(gòu)建了MC4200菌株，使其獲得正常的嚴(yán)緊反應(yīng)能力。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了MC4200的maz EF、maz G、maz EFG基因敲除菌株，分別標(biāo)識為4200、4200△EF、4200△G和4200△EFG。文獻表明[10],maz G基因在大腸桿菌maz EFG敲除菌株中過表達會顯著抑制大腸桿菌的生長。為進一步探究maz G的細胞毒性與maz EF的關(guān)系及其對細菌生存率的影響，我們分別向MC4200和MC4200△EFG菌株轉(zhuǎn)入構(gòu)建好的p BAD33-maz G載體，將陽性轉(zhuǎn)化菌株分別命名為4200G和4200G△EFG。通過添加阿拉伯糖誘導(dǎo)Maz G蛋白的表達，觀察其對菌株生存率的影響。結(jié)果顯示4200G△EFG菌株過表達maz G時，其生長速度（G=1.757±0.001495,n=3）明顯低于未添加Arab的4200G△EFG菌株（P<0.01），該結(jié)果與文獻結(jié)果[10]吻合（圖1）。但引人注意的是，在4200G菌株過表達maz G時，生長速度（G=1.246±0.001633,n=3）則與未添加Arab時4200G菌株無明顯差異（圖1）。這說明maz G基因過表達時，顯著抑制了細胞的正常生長，且這種細胞毒性與maz EF密切相關(guān)。這一結(jié)果表明，maz EFG操縱子作為一個整體共同發(fā)揮作用，它們在調(diào)控細菌生長抑制與凋亡中具有協(xié)同效應(yīng)，maz EF基因?qū)az G可能具有負(fù)調(diào)控作用。2.2 Maz G的細胞毒性依賴于其d NTP焦磷酸水解酶活性
圖2 不同物種來源MazG蛋白的序列比對注：VWQ04633.1：大腸桿菌；CNG39363.1：結(jié)核分枝桿菌；ACN47095.1：沙門氏菌；CYB76634.1：金黃色葡萄球菌為排除極化效應(yīng)對實驗結(jié)果的影響，在MC4200、MC4200△maz G及MC4200△EFG菌株中轉(zhuǎn)入p BAD-maz G質(zhì)粒，對應(yīng)菌株標(biāo)記為MC4200G、MC4200G△maz G及MC4200G△maz EFG。通過加入Ara誘導(dǎo)maz G基因的表達以回補Maz G，比較回補菌株與野生型菌株在10μg/ml利福平刺激下的存活率。Western印跡法結(jié)果表明（圖8），阿拉伯糖的加入成功誘導(dǎo)了Maz G的表達（攜帶6*His標(biāo)簽，圖8B）。maz G基因回補后，MC4200菌株和MC4200△G菌株與野生型菌株無顯著差異，這說明maz G的敲除并未影響其上游maz EF的表達，未產(chǎn)生“極化效應(yīng)”。而MC4200△EFG在Maz G回補后，細菌存活率會顯著低于野生型菌株（P<0.01），這是由于maz G的活性所致，該結(jié)果與本文圖1結(jié)果及文獻[11]結(jié)果吻合。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]毒素-抗毒素系統(tǒng)及其典型模型研究進展[J]. 熊建偉,杜現(xiàn)禮,車永勝,陳依軍. 藥物生物技術(shù). 2017(05)
本文編號：3471107
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