苗期低溫會影響普通煙草（Nicotiana tabacum）正常生長發(fā)育,導(dǎo)致生長勢弱,葉數(shù)減少,葉片窄小,煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量降低。前期研究發(fā)現(xiàn),低溫脅迫條件下茉莉酸信號途徑和合成途徑中關(guān)鍵基因表達(dá)量上升。NINJA蛋白是茉莉酸信號途徑中聯(lián)系JAZ蛋白與下游轉(zhuǎn)錄因子的重要因子,煙草NtNINJA基因和NtJAZ1基因的功能關(guān)系并不明晰。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可運(yùn)用于基因功能驗證。本實(shí)驗運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對普通煙草NtNINJA進(jìn)行基因編輯,利用熒光定量PCR技術(shù),測定T₀代突變株和野生型植株在低溫脅迫和常溫條件下NtJAZ1的表達(dá)量,了解在NtNINJA基因突變下,NtJAZ1基因表達(dá)量差異,為下一步解析NtNINJA突變對NtJAZ1的表達(dá)的影響奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.使用靶位點(diǎn)1（F:5-GTTGCAATCCTTAAGGCGTT,R:5-AACGGGTTAA GGATTGCAAC）和靶位點(diǎn)2（F:5-AAAGAACACGTCCTATTAAG,R:5-CTTAA TAGGACGTGTTCTTT）序列作為靶位點(diǎn)能夠編輯普通煙草品種紅... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 基因編輯技術(shù)
        1.1.1 基因編輯技術(shù)簡介
        1.1.2 基因編輯技術(shù)發(fā)展歷程
    1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)
        1.2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史
        1.2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
        1.2.3 CRISPR/Cas的分類
        1.2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理
        1.2.5 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在重要作物中的應(yīng)用
        1.2.6 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)最新研究進(jìn)展
    1.3 茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
        1.3.1 茉莉酸的生物合成
        1.3.2 茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
        1.3.3 NtNINJA基因和JAZ蛋白家族
    1.4 茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與應(yīng)答低溫脅迫
        1.4.1 應(yīng)答低溫脅迫的基因
        1.4.2 茉莉酸提高植物寒冷防御能力
第2章 引言
    2.1 研究的目的與意義
    2.2 研究內(nèi)容
    2.3 技術(shù)路線
第3章 CRISPR/Cas9編輯煙草NtNINJA基因
    3.1 材料與方法
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株與載體
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基配方
        3.1.5 大腸桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)基配方
        3.1.6 農(nóng)桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)基配方
        3.1.7 主要試劑溶液
        3.1.8 引物
    3.2 表達(dá)載體構(gòu)建
        3.2.1 pCACas9骨架載體的獲得
        3.2.2 sgRNA質(zhì)粒的獲得
        3.2.3 靶位點(diǎn)設(shè)計、選擇
        3.2.4 靶位點(diǎn)的sgRNA組裝
        3.2.5 sgRNA插入pCACas9骨架載體
        3.2.6 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
    3.3 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
        3.3.1 煙草無菌苗的獲得
    3.4 突變體篩選及檢測
        3.4.1 CTAB法提取煙草基因組DNA
        3.4.2 突變體篩選
        3.4.3 突變類型的測定
    3.5 結(jié)果與分析
        3.5.1 pCACas9-NtNINJA-AB表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.5.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化
        3.5.3 CRISPR/Cas9編輯煙草NtNINJA基因的T0代轉(zhuǎn)基因植株NtNINJA基因突變情況分析
    3.6 本章小結(jié)
第4章 NtNINJA基因堿基缺失煙草植株的克隆與序列分析
    4.1 材料
    4.2 方法
        4.2.1 突變型NtNINJA引物設(shè)計
        4.2.2 總RNA的提取
        4.2.3 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
        4.2.4 PCR擴(kuò)增
        4.2.5 目的基因膠回收
        4.2.6 連接與轉(zhuǎn)化
        4.2.7 重組質(zhì)粒的檢測與測序
        4.2.8 生物信息學(xué)分析
    4.3 結(jié)果分析
        4.3.1 煙草總RNA的提取檢測
        4.3.2 突變型NtNINJA的PCR擴(kuò)增與膠回收
        4.3.3 突變型NtNINJA的菌液PCR檢測
        4.3.4 突變NtNINJA序列生物信息學(xué)分析
    4.4 本章小結(jié)
第5章 低溫條件下NtNINJA基因突變型煙草茉莉酸途徑關(guān)鍵基因NtJAZ1的定量表達(dá)分析
    5.1 材料
    5.2 方法
        5.2.1 材料處理
        5.2.2 取樣
        5.2.3 總RNA的提取
        5.2.4 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
        5.2.5 引物設(shè)計
        5.2.6 定量PCR擴(kuò)增
    5.3 結(jié)果分析
        5.3.1 提取RNA的檢測
        5.3.2 NtJAZ1在不同處理中的表達(dá)量分析
    5.4 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論與討論
    6.1 結(jié)論
        6.1.1 SgRNA/Cas9編輯紅大NtNINJA基因
        6.1.2 突變NtNINJA基因的克隆及生物信息學(xué)分析
        6.1.3 低溫脅迫NtNINJA基因突變型煙草NtJAZ1的定量表達(dá)分析
    6.2 討論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]基于CRISPR/Cas9技術(shù)的水稻轉(zhuǎn)錄因子tify1a和tify1b突變體的創(chuàng)建與分析[J]. 黃小貞,曾曉芳,李建容,趙德剛.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報. 2017(06)
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博士論文
[1]利用TALENs和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)改良水稻稻瘟病抗性[D]. 王福軍.廣西大學(xué) 2016



本文編號：3451431