基因編輯（gene editing）,又稱基因組編輯（genome edting）或基因組工程（genome engineering）,是通過對生物體某些特定的基因進行比較精確的增添或者刪減從而滿足人類的某些需求衍生出的一項基因工程技術(shù)或過程。與傳統(tǒng)的基因工程相比較,基因編輯可以直接作用于細(xì)胞染色體的特性,使得其實用性獲得了更大的提升。CRISPR/Cas是目前基因編輯領(lǐng)域最前沿最火熱的基因編輯技術(shù),其低成本高效率易操作的優(yōu)點大大促進了基因編輯技術(shù)的發(fā)展。CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛存在于自然界細(xì)菌和古生菌中,是細(xì)菌和古生菌面對外源DNA的入侵而產(chǎn)生的一種自我免疫的機制。對CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9和V型Cpf1具有基因編輯的作用,其中CRISPR-Cas9最具有典型性,但是CRISPR-Cas9也存在著對某些生物不相融,高脫靶率的問題。通過對本實驗室自行分離純化得到的維吉尼亞鏈霉菌IBL14（Streptomyces virginiae IBL14）的全基因組測序發(fā)現(xiàn)其染色體的兩個CRISPR位點之間存在著一個Cas順序為cas7,cas5,cas3,c... 

【文章來源】：安徽大學(xué)安徽省 211工程院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR-Cas系統(tǒng)免疫原理

制藥廠污泥中發(fā)現(xiàn)并分離提純而來的一種放線菌，在革蘭氏染色實驗中發(fā)現(xiàn)其為陽性菌株，初步實驗后本實驗室委托蘇州眾信生物技術(shù)有限公司對IBL14進行了全基因組的測序。通過全基因組的分析發(fā)現(xiàn)該生物存在著cas3介導(dǎo)的CRISPR-Cas系統(tǒng)，之后的對比分析中我們可以確認(rèn)該系統(tǒng)屬于Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的一個亞型[25]。對IBL14全基因組進行分析時我們發(fā)現(xiàn)其存在著18個CRISPER位點，其中兩個位點之間存在著一個Cas順序為cas7,cas5,cas3,cas4,cas1,cas2的蛋白群，他們位于同一操縱子上，我們將其命名為I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)[26]。圖1.3I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Figure1.3thestructureofI-B-sviCRISPR-Cassystem本實驗室對I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)的開發(fā)一直都在緊鑼密鼓的進行著，其中雍德祥[27]，許鑫[28]，邱彩花[29]對利用本系統(tǒng)自打靶做出了突出貢獻，楊興旺[30]，孫焰[31]利用該系統(tǒng)在大腸桿菌中實現(xiàn)了基因編輯,夏婷婷[32]拓展了本系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中的應(yīng)用，曹素麗[33]一直在進行原始菌株的工作。唐嚴(yán)嚴(yán)[34]更是實現(xiàn)了該系統(tǒng)在人體細(xì)胞中基因編輯的突破。王安靜[35]利用I-B-sviCRISPR-Cas系統(tǒng)對真核微生物進行了基因敲除。1.3研究的意義內(nèi)容和方案1.3.1CRISPR-Cas系統(tǒng)指導(dǎo)基因組編輯的分子原理當(dāng)同源DNA序列存在時，宿主基因組中末端錯位的致命雙鏈斷裂(DSB)DNA通�？梢酝ㄟ^細(xì)胞自身的同源指導(dǎo)修復(fù)(HDR)機制(頻率較低，錯誤較少)修復(fù)[36]，這種修復(fù)通過將兩端分別有兩個互補序列的工程同源DNA片段(或模板DNA/t-DNA)引入到DSB產(chǎn)品的末端來構(gòu)建基因組編輯的基礎(chǔ)[37]。此外當(dāng)缺乏同源DNA序列時尤其是缺失鈍端

第一章緒論4的基因組DSB產(chǎn)品中，會出現(xiàn)非同源性末端接合(NHEJ)(頻率更高，錯誤更多)，這通常會導(dǎo)致核苷酸插入或缺失(indels)1的幀移位突變[38]。在CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的內(nèi)源性基因組編輯中，一系列基因編輯工具(通常包括t-DNA、g-DNA、Cas、遺傳標(biāo)記和載體/質(zhì)粒)導(dǎo)入宿主細(xì)胞后產(chǎn)生的分子事件主要包括:(i)Cas基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯(通常包括t-DNA和載體的重復(fù))，(ii)g-DNA的轉(zhuǎn)錄和加工形成crRNA，(iii)Cas對內(nèi)源性DNA的定點切割，(iv)靶基因序列與t-DNA的同源重組。顯然事件(i)和(iv)完全由宿主細(xì)胞和質(zhì)粒中的分子組分實現(xiàn)，只有事件(ii)和(iii)應(yīng)由Cas(es)1,2完成。實際上通過對crRNA進行優(yōu)化，將由啟動子、crRNAcDNA和終止子組成的g-DNA整合到載體中，可以很容易地實現(xiàn)上述功能[39]。因此基因組編輯中的事件(iii)是一個關(guān)鍵步驟應(yīng)該通過具有相同功能的限制性內(nèi)切酶來實現(xiàn)。圖1.4CRISPR-Cas系統(tǒng)指導(dǎo)基因組編輯的分子原理Figure1.4ThemolecularprincipleofCRISPR-Cassystemguidinggenomeediting1.3.2本課題的研究意義探究堿基優(yōu)化后的I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)在釀酒酵母進行的基因敲除具有重要的意義，首先能夠補充該系統(tǒng)在真核生物探究的缺失，進一步證明維吉尼亞鏈霉菌自身的CRISPR-Cas系統(tǒng)可應(yīng)用到其它生物中。其次為基于2類II型與V型CRISPR-Cas系統(tǒng)進行的真核生物基因編輯提供了新的補充和選擇。最后應(yīng)用該系統(tǒng)對真核生物釀酒酵母基因組可方便、快速、有效地進行基因編輯。對脫靶實驗的探究讓整個實驗更加的嚴(yán)謹(jǐn)也論證了我們對該系統(tǒng)低脫靶率的推理。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]番茄紅素對非酒精性脂肪肝大鼠糖脂代謝及炎癥水平的影響[J]. 張配配,李景賢,李蒙麗,隋源,周鈺浩,孫永葉.  衛(wèi)生研究. 2020(02)
[2]Cpf1核酸酶的原核表達、純化及多克隆抗體制備與鑒定[J]. 董彬,王君,孫靜,王報貴,孫春龍,吳濤.  生物學(xué)雜志. 2020(06)

碩士論文
[1]I-B-Svi型CRISPR-Cas3系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞中的基因編輯[D]. 唐嚴(yán)嚴(yán).安徽大學(xué) 2019
[2]I-B-Svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中的基因編輯[D]. 夏婷婷.安徽大學(xué) 2019
[3]釀酒酵母合成番茄紅素的途徑優(yōu)化研究[D]. 李霞.石河子大學(xué) 2018
[4]維吉尼亞鏈霉菌IBL14中sviscsn基因簇功能分析[D]. 許鑫.安徽大學(xué) 2017
[5]維吉尼亞鏈霉菌IBL14中I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)及青霉素代謝相關(guān)酶基因自敲除[D]. 邱彩花.安徽大學(xué) 2017
[6]維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系統(tǒng)及其基因編輯方法[D]. 雍德祥.安徽大學(xué) 2016



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