基因定點編輯技術為植物功能基因研究和作物遺傳育種提供了重要的技術支撐。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)作為當前最熱門的基因編輯技術,其作用原理主要由sgRNA靶向目的DNA序列并與之結合,從而激活Cas9的核酸酶切割靶DNA,產(chǎn)生靶序列DNA雙鏈斷裂（DSB）的損傷。通過非同源末端連接與同源重組的修復方式在靶位點處產(chǎn)生DNA片段的插入或缺失或在靶位點處敲入外源片段或引入點突變,以此來實現(xiàn)對目的基因的突變。另外,在DNA修復機制中,同源重組的效率遠遠低于非同源末端連接,導致靶位點處修復結果不可控。而單堿基編輯技術在不依賴雙鏈斷裂的條件下實現(xiàn)對目標基因片段中特定位點的單個堿基進行轉(zhuǎn)換,可以實現(xiàn)目標基因的精確修飾。目前已開發(fā)出實現(xiàn)靶序列中C/G→T/A轉(zhuǎn)換的CBE編輯器和A/T→G/C轉(zhuǎn)換的ABE編輯器,這些單堿基編輯器針對目標基因的修飾可以不再依賴于DNA雙鏈斷裂且能產(chǎn)生4種形式的堿基轉(zhuǎn)換,既規(guī)避了HR修復途徑效率低的限制,也擺脫了NHEJ修復途徑的隨機性。植物的成花過程受外部環(huán)境的影響與錯綜復雜的內(nèi)源基因調(diào)控。FT、CO調(diào)控植物開花進程,突變FT、CO基因使其在植物體內(nèi)的表達量降低或不... 

【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

TALEN作用原理示意圖（沈延等，2013）

西南大學碩士學位論文4圖1-2CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用原理示意圖（Wiedenheftetal.，2012）Figure1-2SchematicdiagramofCRISPR/Cas9systemprinciple(Wiedenheftetal.,2012)1.1.3.2CRISPR/Cas介導的多基因編輯CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物體細胞內(nèi)工作時每個sgRNA都具有獨立性，這使其在同一個體實現(xiàn)多位點或多基因的編輯成為可能。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要由sgRNA與Cas9蛋白組成，sgRNA識別并導向Cas9蛋白對靶位點的切割，因此，CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向精確性很大程度上取決于sgRNA生成。研究發(fā)現(xiàn)tRNA大量存在于生物體細胞內(nèi)，能在細胞內(nèi)迅速加工合成，其合成機制與生物體自身的單個多順反子基因合成的小片段RNA的機制非常相似（Nakajimaetal.，1981；Kruszkaetal.，2014）。BoxA和BoxB作為tRNA內(nèi)部啟動原件能招募RNA聚合酶PolⅢ型復合體，此外，RNA聚合酶PolⅢ型啟動子的表達也能在tRNA序列的作用下加強（Diecietal.，2007；Whiteetal.，2011）�；谝陨显�，研究者將tRNA與gRNA進行結合，一種能夠同時產(chǎn)生大量gRNA的多順反子結構tRNA-gRNA的創(chuàng)制得以實現(xiàn)（Xieetal.，2015）。CRISPR/Cas9表達載體中tRNA組分被內(nèi)源tRNA加工系統(tǒng)識別并將gRNA從tRNA-gRNA轉(zhuǎn)錄物中切除出形成單個獨立的gRNA，細胞內(nèi)大量存在的gRNA引導Cas9靶向多個目標位點進行基因組編輯。此外，Ma等應用PCR程序原理使多個表達盒sgRNA能夠快速的得到，由Gibson或GoldenGate構建二元表達載體，再與經(jīng)過優(yōu)化的Cas9蛋白結合，實

第1章文獻綜述5現(xiàn)了在雙子葉和單子葉植物中的多基因編輯，這大大提高了突變效率。圖1-3基于內(nèi)源tRNA表達加工的CRISPR/Cas9多基因編輯原理圖（Xieetal.，2015）Figure1-3SchematicdiagramofCRISPR/Cas9multigeneeditingbasedonendogenoustRNAexpressionprocessing(Xieetal.,2015)1.1.3.3CRISPR/Cas9技術在作物中的應用自然進化過程中基因突變是生物多樣性的重要來源，在作物育種中基因突變也為優(yōu)良品種的選育提供了更多的選擇。盡管物理誘變（如γ射線）和化學誘變（如亞硝基乙基脲NEH和甲基磺酸乙酯EMS）的方法能引入植物基因的突變，但此種方法引入的基因突變具有隨機性而且難以實現(xiàn)目標性狀的定向突變，在作物育種方面難以廣泛應用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能實現(xiàn)目的基因的精準打靶完成定向突變，此系統(tǒng)至開發(fā)以來即被育種家們廣泛應用于作物育種，迅速成為了作物遺傳育種中的熱門技術。在水稻中Gn1a、DEP1、GS3、IPA1分別控制水稻穗粒數(shù)、直立密穗、單粒重和分蘗數(shù)，Li等利用CRISPR/Cas9技術對這上述基因進行突變，成功創(chuàng)制了優(yōu)良性狀的水稻品種，大幅度的提高了產(chǎn)量（Lietal.,2016）。此外，利用此系統(tǒng)進行水稻抗病基因與抗除草劑基因的編輯，獲得了抗稻瘟病和抗除草劑的水稻品種（Liuetal.,2012；Sunetal.,2016）。在玉米育種中，育種家一直探索著降低玉米中的肌醇六磷酸（PA），因為這類物質(zhì)對于單胃動物來說難以吸收消化。ZmIPK1A、ZmIPK、ZmMRP基因控制著PA合成途徑，Liang等應用CRISPR/Cas9技術成功敲除ZmIPK基因，大幅度降低了玉米中的PA含量（Liangetal.,2014）。另外，CRISPR/Cas9技術也被用于玉米代謝途徑調(diào)控（Fengetal.,2016）、鹽脅迫（Xingetal.,2014）和干旱脅迫（Habbenetal.,2014；Shietal.,2016）等基因編輯。


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