發(fā)布時間：2021-09-07 19:55

　　建立基于CRISPR/Cas9的基因轉(zhuǎn)錄激活技術,實現(xiàn)在HEK293細胞中激活cGAS基因的轉(zhuǎn)錄。首先利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定表達Cas9的HEK293細胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鑒定Cas9蛋白質(zhì)表達效果。再選取不同靶序列,分別構(gòu)建用于激活cGAS基因轉(zhuǎn)錄的sgRNA載體,將構(gòu)建好的序列載體與CRISPR體系工具質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達Cas9的HEK293細胞中。采用Real-time PCR方法檢測細胞中內(nèi)源cGAS的轉(zhuǎn)錄激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因轉(zhuǎn)錄激活技術,并在c GAS基因陰性表達的細胞中激活基因的轉(zhuǎn)錄。 

【文章來源】：科學技術與工程. 2016,16(20)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料
    1.1 主要試劑
    1.2 主要儀器
2 方法
    2.1 構(gòu)建穩(wěn)定表達Cas9的HEK293細胞
        2.1.1 病毒包裝
        2.1.2 HEK293細胞的病毒感染
        2.1.3 感染細胞中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定表達效果檢測
    2.2 sgRNA靶序列設計
    2.3 CRISPR轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)源蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建及陽性克隆的篩選
    2.4 鑒定CRISPR調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄效應
3 結(jié)果
    3.1 Cas9的穩(wěn)定表達檢測
    3.2 c GAS-sgRNA(MS2)陽性克隆驗證及測序
    3.3 c GAS的表達水平檢測
4 討論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]COPS3的穩(wěn)定干涉細胞系建立及其在NLRP3炎癥小體激活中的作用[J]. 郭賽賽,常艷,涂海情,徐廣,秦璇和,吳敏,李慧艷,李愛玲.  科學技術與工程. 2015(19)
[2]新型胞質(zhì)DNA感受通路:cGAS-STING的研究進展[J]. 丁亮,泥艷紅,胡勤剛,侯亞義.  生物化學與生物物理進展. 2014(09)



本文編號：3390159