丹參（Salvia miltiorrhiza）為唇形科鼠尾草屬多年生雙子葉植物,其干燥根及根莖是我國傳統(tǒng)中藥材之一,CRISPR/Cas9為一種新型定點基因編輯技術。本研究基于CRISPR/Cas9技術,以酚酸類成分含量較高的山農(nóng)丹參1號為材料,確定在該技術中應用較多的篩選劑潮霉素的篩選濃度以及適合丹參的除菌抗生素的種類和濃度。采用單因素試驗和正交試驗設計從超聲波預處理時間、乙酰丁香酮濃度、侵染濃度、侵染時間四個因素進行探索,對農(nóng)桿菌介導的丹參遺傳轉化體系進行優(yōu)化,然后以丹參酚酸合成途徑中的關鍵酶基因SmPAL1為目標基因對其進行編輯。對SmPAL1基因的靶位點進行體外靶點效率檢測并構建CRISPR/Cas9載體,通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法將構建好的VK005-03表達載體轉入丹參受體材料山農(nóng)丹參1號中,獲得了新的轉基因植株。主要結果如下:1、通過對丹參愈傷組織誘導優(yōu)化,潮霉素濃度的篩選,除菌抗生素的篩選以及超聲波預處理時間、侵染濃度、乙酰丁香酮濃度、侵染時間四個因素進行單因素試驗和正交試驗,獲得了一套穩(wěn)定高效的丹參遺傳轉化體系。2、設計了3個CRISPR/Cas9靶位點（SmPAL... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

丹參無菌苗Fig.1AsepticseedlingofSalviamiltiorrhiza

濃度Concentration/mg·LCallus rate/% 平均值重復ⅠAverage value/%Repeat Ⅰ重復ⅡRepeat Ⅱ重復ⅢRepeat Ⅲ0.01 87.6 87.9 88.2 87.9d0.02 88.7 87.4 88.2 88.1d0.03 92.4 92.6 93.7 92.9c0.04 95.6 96.3 95.2 95.7b0.05 100.0 100.0 100.0 100.0a當培養(yǎng)基中只添加 6-BA 時，丹參出愈率隨著 6-BA 濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下勢，濃度為 3 mg/L 時，出愈率最高，顯著高于其他濃度處理，選擇 6-BA 濃度為g/L。當培養(yǎng)基中只添加 NAA 時，濃度為 0.2 mg/L 丹參出愈率最高，顯著高于其處理，且葉片能夠全部分化出綠色愈傷組織（圖 2）。當培養(yǎng)基中只添加 2, 4-D 時為 0.05 mg/L 丹參出愈率達到了 100.0%，葉片分化出綠色愈傷組織且質地緊密（根據(jù)以上結果選擇在MS培養(yǎng)基中添加3 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的NAA和0.05mg2, 4-D 為誘導愈傷培養(yǎng)基。

濃度為 0.05 mg/L 丹參出愈率達到了 100.0%，葉片分化出綠色愈傷組織且質地緊密（圖3）。根據(jù)以上結果選擇在MS培養(yǎng)基中添加3 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的NAA和0.05mg/L的 2, 4-D 為誘導愈傷培養(yǎng)基。A B C圖 2 含不同激素的培養(yǎng)基中丹參愈傷A: 6-BA(3 mg/L); B: NAA (0.2 mg/L); C: 2, 4-D (0.05mg/L)Fig. 2 Salvia miltiorrhiza callus in mediums containing different hormonesA: 6-BA(3 mg/L); B: NAA (0.2 mg/L); C: 2, 4-D (0.05mg/L)

【參考文獻】：
期刊論文
[1]農(nóng)桿菌介導轉Bt基因海島棉的獲得及抗棉鈴蟲效果分析[J]. 鄧莉,張霞,曲延英,李娟,郭家雁,陳全家.  分子植物育種. 2018(02)
[2]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建FGF21基因敲除小鼠模型[J]. 劉旭,張平,張曉楓,李興,白宇,賈克榮,郭曉東,張豪,馬曉燕,倉明,劉東軍,郭旭東.  遺傳. 2018(01)
[3]利用CRISPR-Cas9基因編輯技術獲得AtLCR67基因敲除突變體[J]. 劉詢,龐奧運,劉春林,阮穎.  分子植物育種. 2017(06)
[4]過表達丹參GGPPS研究丹參酮類的生物合成途徑[J]. 楊悅,楊長青,王勇,楊蕾.  中國科學:生命科學. 2017(05)
[5]CRISPR/Cas9介導的高產(chǎn)谷胱甘肽原養(yǎng)型酵母工程菌的構建[J]. 周文龍,唐亮,成凱,劉忞之,楊燕,王偉.  生物工程學報. 2017(12)
[6]生菜CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立[J]. 禹明森,李翔,高馬也,楊蕾,倪迪安,王應祥.  植物生理學報. 2017(04)
[7]香蕉CRISPR/Cas9基因編輯技術體系的建立[J]. 胡春華,鄧貴明,孫曉玄,左存武,李春雨,鄺瑞彬,楊喬松,易干軍.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2017(07)
[8]利用CRISPR/CAS9技術編輯水稻香味基因Badh2[J]. 邵高能,謝黎虹,焦桂愛,魏祥進,圣忠華,唐紹清,胡培松.  中國水稻科學. 2017(02)
[9]利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術定向敲除煙草eIF4E-6基因[J]. 潘洪杏,劉俠,萬秀清,喬嬋,宋琳娜,郭兆奎,李若.  分子植物育種. 2017(02)
[10]不同濃度氮磷配比對丹參生長和活性成分積累的影響[J]. 夏貴惠,王秋玲,王文全,侯俊玲,宋慶燕,羅琳,張豆豆,楊相.  中國中藥雜志. 2016(22)

博士論文
[1]丹參基因工程體系創(chuàng)新優(yōu)化及次生代謝調控應用研究[D]. 劉玉.電子科技大學 2017

碩士論文
[1]土壤條件對不同品系丹參產(chǎn)量和品質的影響[D]. 趙琦.山東農(nóng)業(yè)大學 2016
[2]丹參轉錄因子基因SmPAP1的轉錄自激活及其調控丹參次生代謝途徑的研究[D]. 李晶.陜西師范大學 2016
[3]若干丹參酚酸的降解和解離性質研究[D]. 黃世超.浙江大學 2016
[4]丹參遺傳連鎖圖譜構建及QTL分析[D]. 宗成堃.山東農(nóng)業(yè)大學 2015
[5]丹參遺傳轉化體系的構建及SmGGPPS和SmKSL的轉基因研究[D]. 成海寧.東北林業(yè)大學 2014
[6]紅掌花PAL基因的克隆與花色苷含量的研究[D]. 李穎穎.海南大學 2012
[7]轉錄因子PAP2對丹參酚酸類產(chǎn)物合成的影響[D]. 劉芬.陜西師范大學 2011
[8]丹參酮生物合成相關基因的克隆及其代謝調控[D]. 廖攀.上海師范大學 2010
[9]丹參CPS基因表達載體構建及其對丹參遺傳轉化的研究[D]. 胥彬.長春中醫(yī)藥大學 2009
[10]丹參苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL1）的克隆及其功能初探[D]. 宋婕.陜西師范大學 2007



本文編號：3385337