為研究煙草5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶（1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR）基因的表達(dá)模式和功能,從普通煙草（Nicotiana tabacum）品種紅花大金元中克隆了NtDXR基因,并通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析了NtDXR在紅花大金元不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中的表達(dá)模式。同時(shí)利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了NtDXR敲除載體,獲得了DXR基因突變的植株。結(jié)果表明:NtDXR基因在花中的表達(dá)量最高,在雌蕊和葉中次之;利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除NtDXR基因后,檢測(cè)目的基因靶位點(diǎn)序列發(fā)現(xiàn)有堿基的插入、缺失與置換,并且部分T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株呈現(xiàn)白化表型,暗示NtDXR基因在煙草葉綠素等色素合成過(guò)程中起重要作用,推測(cè)NtDXR基因的突變能阻斷煙草質(zhì)體色素的合成。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)煙草學(xué)會(huì)2016年度優(yōu)秀論文匯編——煙草農(nóng)業(yè)主題中國(guó)煙草學(xué)會(huì)專題資料匯編

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刀理DXR序列比對(duì)結(jié)果

2016煙草科技年長(zhǎng)度為1500bp左右的片段（圖1）。將測(cè)序結(jié)果與紅大基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖2）表明，該序列與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中DXR基因的mRNA序列相似度為99%，所得目的片段為NtDXR基因序列。2.2NtDXR基因表達(dá)模式分析提取普通煙草紅大不同時(shí)期、不同組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用NtGAPDH基因檢測(cè)cDNA質(zhì)量。電泳結(jié)果（圖3）表明，cDNA質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。熒光定量PCR結(jié)果（圖4）表明，NtDXR在不同組織中的表達(dá)量各有不同，在花、葉、雌蕊中的表達(dá)量較高，莖尖次之，根、莖、雄蕊中表達(dá)量較低。M.Trans2KDNAMarker1.NtDXR基因片段圖1NtDXRPCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1ElectrophoretogramofNtDXRPCRamplificationNtDXR.本實(shí)驗(yàn)中克隆的序列DXR.煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列圖2NtDXR序列比對(duì)結(jié)果Fig.2SequencealignmentofNtDXRM.Trans2KDNAMarker1~10.依次為大十字期根、大十字期莖、大十字期葉、大十字期莖尖、成熟期根、成熟期莖、成熟期葉、花、雌蕊、雄蕊圖3cDNA質(zhì)量檢測(cè)圖Fig.3ElectrophoretogramofcDNA圖4NtDXR基因在煙草不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中的表達(dá)Fig.4SpatialandtemporalexpressionpatternsofNtDXR·4·

第49卷第6期2.3NtDXR基因敲除載體構(gòu)建菌落PCR擴(kuò)增出500bp左右大小的片段（圖5a），表明菌落可能為陽(yáng)性克攏將菌液送至北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序，結(jié)果（圖5b）顯示插入目的片段中含有靶位點(diǎn)20bp的核苷酸序列，表明靶位點(diǎn)已成功插入到pORE-Cas9/gRNA載體中，即敲除載體構(gòu)建成功（圖5c）。2.4NtDXR轉(zhuǎn)基因煙株的檢測(cè)通過(guò)構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除載體及運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)，獲得了具有抗卡那霉素的T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗。提取陽(yáng)性煙苗葉片基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)外源插入DNA片段。電泳結(jié)果（圖6）表明，擴(kuò)增的目的片段大小為390bp，與引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增序列的大小一致，初步表明在抗性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的煙苗基因組內(nèi)均插入敲除載體序列，即NtDXR敲除載體已成功轉(zhuǎn)入到煙草植株中。2.5T0代轉(zhuǎn)基因煙草表型觀察及驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因組培幼苗大部分植株呈綠色（圖7a），與正常煙草組培苗表型無(wú)差異。在T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗中，發(fā)現(xiàn)4株與其他陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗表型完全不同的植株，表現(xiàn)為白化表型（圖7b）。以陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙苗基因組DNA為模板，用DXR-jiance-F和DXR-jiance-R引物擴(kuò)增含有NtDXR基因的靶位點(diǎn)片段，共檢測(cè)4株白化苗和15株綠色苗中NtDXR基因序列的突變形式，并對(duì)不同突變形式出現(xiàn)的概率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果（表1、圖8）表明，在4株白化苗中，所測(cè)得的NtDXR基因靶位點(diǎn)序列均出現(xiàn)不同形式的突變，包括堿基的插入、缺失，但并沒(méi)有檢測(cè)到與野生型煙草NtDXR相一致的序列。4株白化苗NtDXR基因靶位點(diǎn)序列有3種突變形式，第一種是在靶位點(diǎn)附近增加1個(gè)堿基T或A；第二種是在靶位點(diǎn)附近丟失7個(gè)堿基；第三種是在靶位點(diǎn)附近丟失1個(gè)堿基T。這3種突變形式均能導(dǎo)致NtDXR蛋白翻譯錯(cuò)誤，從而使蛋白喪失功能。在15株轉(zhuǎn)基因綠色苗中，只有3株煙?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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