昆蟲表皮是昆蟲體壁皮細胞分泌物形成的一種高度有序的層狀結(jié)構(gòu),主要由表皮蛋白（Cuticular Proteins,CP）和幾丁質(zhì)構(gòu)成。表皮蛋白基因的種類和數(shù)量變化是影響表皮結(jié)構(gòu)及其機械性能的主要因素,其中CP中的一類CPR家族在昆蟲中含量最多,具有與幾丁質(zhì)結(jié)合能力的R&R保守序列,分為3個亞族RR-1、RR-2和RR-3,都與昆蟲表皮形成有關(guān)。另一方面,昆蟲表皮的不透明與尿酸鹽顆粒在皮細胞中積累有關(guān),能減少光氧化對昆蟲的刺激。尿酸鹽顆粒轉(zhuǎn)運相關(guān)的BLOS2基因在此過程中起著十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)BLOS2突變會使昆蟲表皮呈半透明狀,而柞蠶中暫未發(fā)現(xiàn)半透明突變體。為了探究CP和BLOS2基因的表達模式及其在柞蠶（Antheraea pernyi）表皮構(gòu)建中的作用,采用分子生物學技術(shù)研究了3個基因特征和表達模式,并通過RNAi技術(shù)探究基因功能,為解析柞蠶體壁的構(gòu)建奠定基礎(chǔ),實驗結(jié)果如下。1.克隆得到了柞蠶RR-1亞族的2種表皮蛋白（cuticular proteins,CPs）基因,分別命名為ApCP12、ApCP23（GenBank登錄號:MF318874、MF318875）。... 

【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

昆蟲體內(nèi)尿酸合成及轉(zhuǎn)運途徑Fig.1-1Uricacidsynthesisandtransportpathwaysininsects

沈陽農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文192.2結(jié)果與分析2.2.1柞蠶CP12和CP23基因的克隆及序列分析參照表2-2中表皮蛋白基因序列擴增引物，分別經(jīng)PCR擴增及3RACE擴增后得到CP12基因長度為690bp，ORF長度為336bp，編碼111個氨基酸，相對分子質(zhì)量為12kD，等電點為4.80。BLASTp分析表明，該基因與天蠶Antheraeayamamai的cuticularprotein1（登錄號:AER27813.1）相似度為92%。根據(jù)預測的分子量大小將其命名為ApCP12（GenBank登錄號：MF318874）。ApCP12預測有一個信號肽（位于1-17位編碼氨基酸，淺灰色部分），具有一個幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域Chitin_bind_4（位于38-97位氨基酸之間，深灰色部分）（圖2-1：A）。柞蠶CP23測序結(jié)果拼接后長度為1243bp，ORF長度為594bp，編碼197個氨基酸，相對分子質(zhì)量為23kD，等電點為5.57。BLASTp分析表明，與家蠶cuticularproteinmotif1（登錄號：NP_001040112.1）的相似度為89%，根據(jù)分子量大小將其命名為ApCP23（GenBank登錄號：MF318875）。ApCP23預測信號肽序列位于1-19個編碼氨基酸（淺灰色部分），幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域Chitin_bind_4位于121-176位氨基酸之間（深灰色部分）（圖2-1：B）。起始密碼子ATG用粗體標注，終止密碼子TAA用粗體和星號標注，淺灰色陰影表示信號肽序列，深灰色陰影表示幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。TheinitiationcodonATGisbold,andtheterminationcodonTAAisboldandmarkedwithanasterisk.Thesignalpeptidesareshadedinlightgrey,andtheconserveddomainsofchitinbindareshadedindarkgrey.圖2-1柞蠶ApCP12(A)和ApCP23(B)的cDNA核酸序列及推導的氨基酸序列Fig.2-1NucleotideanddeducedaminoacidsequencesofApCP12(A)andApCP23(B)ofA.pernyi

CPRR-122（登錄號：NP_001166266.1）；家蠶：CPRR-1motif1（登錄號：NP_001040112.1）；日本天蠶：CPRR-1motif8（登錄號：AER27816.1）；冬尺蠖O.brumata：CPRR-1motif15（登錄號：KOB72386.1）；黑脈金斑蝶D.plexippus：CPRR-1motif17（登錄號：OWR54751.1）；家蠶：CPRR-1motif45（登錄號：NP_001036869.1）等，柞蠶CP12、CP23與以上昆蟲表皮蛋白具有CPR家族RR-1亞族共同的保守基序（GxFxYxxPDGxxxxVxYxADENGYQPxGAHLP），保守序列通過WebLogo分析后生成的序列l(wèi)ogo見圖2-4（圖中字母為氨基酸縮寫，其高低代表保守性）。圖2-49種昆蟲RR-1亞族表皮蛋白的氨基酸序列的WebLogo保守域預測Fig.2-4PredictedWebLogoconservativedomainsofcuticularproteins(CPs)ofsubtribeRR-1innineinsectspecies2.2.3ApCP12和ApCP23基因組織及胚胎發(fā)育期的半定量分析采用半定量RT-PCR檢測柞蠶5齡幼蟲各組織中2種表皮蛋白基因的表達量變化，ApCP12在柞蠶5齡幼蟲的中腸、馬氏管及血淋巴中未檢測到基因表達，而表皮、肌肉、脂肪體、絲腺、腦、精/卵巢中均有表達，ApCP23基因除在柞蠶的表皮、肌肉中表達量較高外，在脂肪體、絲腺、血淋巴、腦、精/卵巢中也有少量表達（圖2-5）。1:表皮Cuticle;2：肌肉Muscles；3:脂肪體Fatbody;4:中腸Midgut;5:絲腺Silkgland;6:馬氏管Malpighiantubes;7:血淋巴Haemolymph;8:腦Brain;9:精/卵巢Spermaries/Ovaries圖2-5柞蠶5齡幼蟲各組織中ApCP12和ApCP23的半定量RT-PCR檢測Fig.2-5Semi-quantitativeRT-PCRdetectApCP12andApCP23expressionindifferenttissuesof5thinstarlarvaeofA.pernyi123456789-actinApCP12ApCP23

【參考文獻】：
期刊論文
[1]柞蠶膽綠素還原酶基因ApBVRB的克隆及表達分析[J]. 苗隆,謝璐,李群,劉彥群.  蠶業(yè)科學. 2019(02)
[2]柞蠶RR-1亞族表皮蛋白基因ApCP12與ApCP23的表達特征與功能分析[J]. 馬月月,劉微,王勇,王德意,雷飄,汝玉濤,姜義仁,楊瑞生,秦利.  昆蟲學報. 2018(02)
[3]蛻皮激素受體和超氣門蛋白基因在柞蠶發(fā)育過程及激素誘導后的表達模式[J]. 汝玉濤,王勇,周敬林,王德意,馬月月,姜義仁,高清,秦利.  蠶業(yè)科學. 2017(04)
[4]飛蝗內(nèi)表皮蛋白基因LmAbd-5的表達與功能分析[J]. 趙小明,賈盼,勾昕,劉衛(wèi)敏,馬恩波,張建珍.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2017(10)
[5]家蠶吡哆醛激酶基因干擾降低轉(zhuǎn)氨酶基因的轉(zhuǎn)錄表達[J]. 姚麗麗,楊歡歡,張劍韻,黃龍全.  昆蟲學報. 2015 (12)
[6]飛蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析[J]. 王燕,李大琪,劉曉健,李濤,馬恩波,范仁俊,張建珍.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2015(01)
[7]昆蟲表皮蛋白基因研究進展[J]. 梁欣,陳斌,喬梁.  昆蟲學報. 2014(09)
[8]褐飛虱表皮蛋白基因NlICP的克隆及功能研究[J]. 馬艷,郝培應,陸潮峰,俞曉平.  昆蟲學報. 2013(11)
[9]內(nèi)體—溶酶體運輸及其細胞功能[J]. 郝振華,李巍.  生命科學. 2010(11)
[10]昆蟲表皮蛋白及其基因表達調(diào)控機理的研究進展[J]. 劉清明,苑園園,林健榮,鐘楊生.  昆蟲知識. 2010(02)



本文編號：3347710