多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）是一類廣泛的存在于植物、動物和微生物中,并且結構復雜的含銅氧化還原酶。在果蔬褐變過程中發(fā)揮重要作用。當果蔬受到機械損傷后,多酚氧化酶在氧氣存在的情況下催化酚類化合物轉化為醌,醌再與氨基酸、蛋白質和酚類物質進行聚合反應形成褐色的聚合物,從而導致果蔬因酶促褐變造成重大損失。本研究利用基因編輯技術CRISPR/Cas9分別對主要存在于馬鈴薯塊莖中的多酚氧化酶基因POT32和POT33進行編輯,以期降低馬鈴薯塊莖受機械損傷引發(fā)褐變發(fā)生率,獲得抗褐化馬鈴薯新種質。該研究對減少果蔬褐變從而提高經濟效益,創(chuàng)制抗褐化種質資源有重大意義。研究取得的主要研究結果如下:1、成功構建靶點特異性gRNA/Cas9植物表達載體并遺傳轉化馬鈴薯本實驗以馬鈴薯大西洋品種作為實驗材料,根據靶點設計要求構建靶點特異性gRNA/Cas9植物表達載體,POT32和POT33基因各兩個靶點,分別記作SG5797、SG5798、SG5799和G5800,采用擬南芥U6啟動子啟動gRNA,并采用加強型CaMV35啟動子高效表達Cas9蛋白,同時表達潮霉素抗性基因。通過農桿菌... 

【文章來源】：貴州大學貴州省 211工程院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

馬鈴薯酶促褐變機理（張學杰等，2000）

2010 ）。核酸酶(ZFNs)基本結構和作用原理(ZFNs)是一種經人工合成的鋅指核酸酶,包括 N 端和 C 端。N 端是由NA 序列的鋅指蛋白(zinc finger protein, ZFP)結構域，C 端是由 Fok I 其中鋅指(zinc finger, ZF)是 ZFP 結構域構成的基本單位，并且 ZF 廣，還能介導蛋白質與核酸、小分子物質或者其它蛋白質之間特異性的10)。ZFP 結構域通常由 3-6 個鋅指的重復單位經過串聯(lián)構成，并且與控相關，其中每個鋅指能夠直接特異性的識別 DNA 雙鏈中其中一條個核苷酸序列，通過將多個鋅指串聯(lián)組成的 ZFP 結構域能夠識別更多也增強 DNA 靶向修飾的特異性(Kim et al., 1996;鐘強和趙書紅,2010)

并且在兩個結合位點間（5-7 bp）發(fā)生切割，引起 DNA 雙鍵出現(xiàn)斷裂 (Miller et al.,985; Wolfe et al., 2000)如圖 2(Porteus et al., 2005)，從而導致同源重組或者非同源末端連對雙鏈的修復，修復過程存在自發(fā)錯誤以及人為引入的變化，從而對基因組 DNA 序引發(fā)改變，實現(xiàn)基因定點的突變目的。.5.2 類轉錄激活因子效應物核酸酶基本結構和作用原理轉錄激活因子效應物核酸酶(TALENs) 是經過人工改造的核酸內切酶，在結構上包括異性蛋白結合域以及非特異性的切割域兩部分( Boch et al, 2009;Moscou et al., Moscout al., 2009)，TALEN 的切割域和 ZFN 的切割域類似，也是 Fok I 內切酶 ；TALEN 的合域是經過人工改造的 TALE 蛋白，TALE 蛋白源自于黃單胞桿菌（Xanthomonas）。 ZFN 相似，根據靶點位置兩側序列設計一對 TALEN，通過特異識別 DNA 序列后，個 Fok I 單體通過相互作用可形成二聚體，再對靶標序列進行切割從而進行基因修飾Boch J, 2011)。

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]采用人造小RNA技術抑制馬鈴薯多酚氧化酶的研究[D]. 池明.西北農林科技大學 2014

碩士論文
[1]應用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得高直鏈淀粉馬鈴薯[D]. 潘京.內蒙古大學 2017
[2]馬鈴薯多酚氧化酶性質及抑制劑作用機理的研究[D]. 黃浩.廈門大學 2006



本文編號：3315700