結(jié)球甘藍（Brassica oleracea L.var.capitata L.）,簡稱甘藍,是十字花科蕓薹屬甘藍種中兩年生的重要蔬菜作物。甘藍為典型的異花授粉作物,具有自交不親和的特點,長期依賴于人工蕾期自交授粉繁殖自交不親和原種,工作量大,雜交率很難達到100%。進入本世紀(jì)以后,甘藍雜交育種的重點轉(zhuǎn)向了雄性不育系的選育和利用。其中細胞質(zhì)雄性不育（CMS）的利用最為普遍,存在恢復(fù)源限制,胞質(zhì)負效應(yīng)、胞質(zhì)單一化等問題。針對當(dāng)前甘藍雄性不育工作中存在的雄性不育遺傳資源狹窄,過度利用蘿卜Ogura CMS不育源,單一胞質(zhì)使用的潛在風(fēng)險以及因嚴重缺乏優(yōu)良甘藍自交親和系制約了甘藍雄性不育雜交育種發(fā)展和應(yīng)用等問題,本研究擬通過甘藍細胞核不育系和自交親和性系的創(chuàng)制,擴大甘藍雄性不育資源,規(guī)避單一胞質(zhì)使用風(fēng)險,促進甘藍雄性不育雜交育種的發(fā)展。隨著控制甘藍雄性不育和自交不親和性基因明確,以基因組編輯為主的反向遺傳學(xué)技術(shù)可以對目的基因的靶位點進行定點改造,為培育自交親和的雄性不育系提供了可能。本試驗以甘藍為研究對象,利用RNAi、優(yōu)化的CRISPR/Cas9等技術(shù),對甘藍BoEMS1、BoSRK以及Bo... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

茉莉酸（JA）生物合成途徑Fig.1-1Biosynthesisofjasmonates

進一步分析 CRISPR/Cas 的結(jié)構(gòu)主要如下三個部分：一個 CRISPR 簇，包括一段非常保守的重復(fù)序列（repeat）和長度相似的間隔序列（spacer）；CRISPR 簇前端的引導(dǎo)序列（leader sequence）；CRISPR 簇側(cè)翼的一些輔助基因（CRISPRassociated genes，cas），如圖 1-2 所示。目前研究發(fā)現(xiàn) CRISPER/Csa9 系統(tǒng)有 3 種，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，由于Ⅰ型和Ⅲ型的工作機制較為復(fù)雜，需要復(fù)雜的 Cas 蛋白系統(tǒng)參與完成。而Ⅱ型只需要 Cas9 這一種蛋白參與免疫過程，其結(jié)構(gòu)組成相對簡單，是目前研究最深入類型(Makarova et al.，2011)。CRISPER/Csa9 Ⅱ型系統(tǒng)一般經(jīng)過3 個階段：（1）間隔區(qū) spacer 的獲得；（2）crRNA（CRISPR-derived RNA）的加工；（3）target 的干擾(Wiedenheft et al.，2012)。第一階段將外源 DNA 片段通過非同源重組整合到 CRISPR 簇中，形成一個新的間隔序列；第二階段的完成是在前導(dǎo)序列 PAMs 作用下的 CRISPR 基因座位點形成前體 RNA（pre-crRNA），通過 Cas9蛋白和 RNAaseⅢ核酸酶的剪切、加工形成成熟 crRNA(Karginov et al.，2010)；第三階段當(dāng)宿主菌再次受到外源 DNA 侵染時，crRNA 和 tracrRNA（trans-activatingchimeric RNA）形成的復(fù)合體特異性結(jié)合外源 DNA，在 Cas9 蛋白核酸內(nèi)切酶的作用下剪切雙鏈 DNA 最終達到保護宿主菌的目的(Garneau et al.，2010)。

(3) tRNA-sgRNA 表達系統(tǒng)CRISPR/Cas9 的靶向能力和多重編輯效率往往會受到 sgRNA 表達策略的限制。為此，賓夕法尼亞大學(xué)的 Yang 教授的研究團隊開發(fā)了一個基于 CRISPR 編輯技術(shù)的新系統(tǒng)，以期尋找一種簡便、高效編輯多基因位點的方法。tRNA 加工系統(tǒng)包含了啟動子元件、poⅢ等，其作用相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄增強子，能夠精確切割 tRNA 前體兩端且 tRNA 大量存在于細胞中，基于以上這些特點研究人員將 tRNA 與 gRNA 結(jié)合起來，合成一個多順反子基因 PTG，將多個 sgRNA 與 tRNA 串聯(lián)在同一表達載體上(Xie et al.，2015)（圖 1-3）。研究顯示，內(nèi)源 tRNA 加工系統(tǒng)能夠精確加工這個合成基因，有效生成大量攜帶正確靶向序列的 gRNA，引導(dǎo) Cas9 編輯多個目標(biāo)染色體。這一策略能夠在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因水稻中高效（高達 100%）實現(xiàn)多重基因組編輯和染色體片段的刪除(Xie et al.，2015)。此后，tRNA-sgRNA 這套系統(tǒng)還成功應(yīng)用于敲除與玉米(Qi et al.，2016)、小麥(Wang et al.，2016)生長發(fā)育相關(guān)的基因，顯著提高了 CRISPR/Cas9 的靶向能力和多重編輯效率，極大程度促進作物遺傳及品種改良等研究。

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的玉米基因組定點編輯研究[D]. 朱金潔.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]四種類型甘藍雄性不育系花藥敗育特征及基因表達譜分析[D]. 康俊根.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2006

碩士論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯甘藍基因的初步研究[D]. 馬存發(fā).西南大學(xué) 2017
[2]擬南芥ms1回復(fù)突變篩選及基因定位[D]. 李亞東.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016



本文編號：3308568