CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)目前已經廣泛地應用于大腸桿菌工程菌株的構建,若能構建出一種能連續(xù)進行基因編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng),將極大地提高大腸桿菌工程菌株構建的效率。設計并構建了具有自剪切功能的供體質粒pV4,優(yōu)化了雙質粒CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),實現(xiàn)了基因的連續(xù)敲除或整合。pV4質粒,在原始供體質粒placZ的骨架區(qū)域添加3個元件:針對供體質粒上氯霉素基因cat的N20-gRNA序列;Ptrc啟動子,用于表達cat-N20-gRNA;lacI^q序列,用于表達LacI蛋白調控Ptrc啟動子。pV4供體系列質粒（敲除或整合）實現(xiàn)基因編輯后,cat-N20-gRNA在IPTG的誘導表達引導Cas9蛋白對供體質粒進行自剪切,從而方便下一輪基因的編輯。將pV4系列質粒（敲除或整合）應用于產衣康酸工程菌株的構建,連續(xù)敲除ptsI、iclR及整合cad基因,基因編輯結果顯示,優(yōu)化后的雙質粒CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),能快速消除供體質粒,實現(xiàn)基因的連續(xù)敲除或整合,節(jié)約了基因操作的時間,有廣泛的工程菌株構建應用前景。 

【文章來源】：生物學雜志. 2020,37(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

優(yōu)化大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)

為優(yōu)化雙質粒CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),實現(xiàn)對基因的連續(xù)編輯,對供體DNA質粒進行了改造:在供體質粒placZ的骨架區(qū)域添加上3個元件:cat-N20-gRNA元件,以placZ質粒為模板,用引物cat-N20-up/cat-N20-down擴增得到,大小400 bp(圖2-A,泳道2);元件lacIq和元件Ptrc在質粒pMACYC184上相鄰,用引物lacI-Ptrc-up/lacI-Ptrc-down擴增得到,大小1.5 kb(圖2-A,泳道3)。將這3個元件和placZ反向擴增的骨架片段(圖2-A,泳道1)用Golden Gate策略組裝,得到pV4質粒(圖2-B)。pV4質粒含有自剪切元件lacIq-Ptrc-cat-N20-gRNA,在IPTG誘導和Cas9蛋白作用下,可以實現(xiàn)質粒的自我消除。2.3 應用優(yōu)化的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)快速構建工程菌株

按照Golden Gate的片段組裝策略,分別組裝ptsI、iclR敲除型質粒和cad整合型質粒。組裝產物轉化Trans T1感受態(tài)細胞,得到的克隆PCR驗證分析后送樣測序,組裝正確的效率達到100%。pV4-del-ptsI,pV4-del-iclR和pV4-del-araBAD-ins-cad的質粒電泳圖,見圖3-D 泳道1、2和3。2.3.2 基因的連續(xù)敲除及其供體質粒的消除

【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas系統(tǒng)在大腸桿菌代謝與發(fā)酵工程中的應用[J]. 王琳,毛旭丹,裘娟萍,孫東昌.  食品與發(fā)酵科技. 2018(03)
[2]代謝工程技術方法研究進展[J]. 楊祖明,李炳志.  生物加工過程. 2018(01)
[3]大腸桿菌染色體上嚴謹型啟動子的構建[J]. 仇煥娜,趙東東,滿淑麗,畢昌昊,朱欣娜,張學禮.  微生物學通報. 2018(08)
[4]質粒消除方法及消除效果的評價研究[J]. 龍海英,劉衡川,方梅.  中國衛(wèi)生檢驗雜志. 2007(03)

碩士論文
[1]改造大腸桿菌提高丁二酸生產速率和轉化率[D]. 陳晶.天津科技大學 2014



本文編號：3251672