為通過慢病毒感染細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CRISPR/Cas9的293T細(xì)胞系,實現(xiàn)高效率基因編輯, PCR擴(kuò)增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒載體pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,將該質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT細(xì)胞, 48 h后收集病毒并濃縮純化測定其病毒滴度,最后用純化后的病毒感染293T細(xì)胞,通過抗性和熒光標(biāo)記篩選得到穩(wěn)定表達(dá)Cas9的細(xì)胞系,并對單克隆細(xì)胞進(jìn)行DNA、RNA特異性和反轉(zhuǎn)錄驗證。針對ABCG4基因設(shè)計sgRNA并構(gòu)建重組載體感染單克隆細(xì)胞,通過DNA特異性和T7E1酶切驗證基因敲除效率。結(jié)果表明:成功構(gòu)建了Cas9-pLent慢病毒載體,用構(gòu)建成功的慢病毒載體對293FT細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝（三質(zhì)粒系統(tǒng)）并對包裝成功的病毒進(jìn)行了濃縮與純化,最后通過病毒感染293T細(xì)胞,采用熒光觀察的方式測定其病毒滴度均在10⁶ TU·mL^-1之上。用純化后的病毒感染293T細(xì)胞并通過加藥（Puro）進(jìn)行抗性篩選,篩選出3株能穩(wěn)定表達(dá)Cas9的293T細(xì)胞系,目的基因ABCG4的... 

【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2020,41(04)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

Cas9-293T單細(xì)胞篩選

Cas9-293T提取RNA驗證

Cas9片段擴(kuò)增產(chǎn)物

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)NTCP的NTCP-SK-Hep1細(xì)胞系構(gòu)建[J]. 勾英,劉正蕓,肖冬焱,周艷萌,羅果,高興紅,王歡.  遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2017(02)
[2]基因編輯技術(shù)最新研究進(jìn)展[J]. 劉玉彪,許馨,曹山虎,孫紹光.  生物技術(shù)通報. 2017(06)
[3]慢病毒包裝體系的建立與體外表達(dá)[J]. 王雪晗,賈俊龍,王維,朱玉博,許諾,白文林,羅光彬.  沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2016(04)
[4]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對人多能干細(xì)胞進(jìn)行高效基因組編輯[J]. 劉改改,李爽,韋余達(dá),張永賢,丁秋蓉.  遺傳. 2015(11)
[5]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 鄭小梅,張曉立,于建東,鄭平,孫際賓.  生物技術(shù)進(jìn)展. 2015(01)
[6]慢病毒載體及其研究進(jìn)展[J]. 孟凡榮,陳琛,萬海粟,周清華.  中國肺癌雜志. 2014(12)
[7]慢病毒載體及其在腫瘤基因治療中的研究應(yīng)用[J]. 牛鑫,鄧志華.  國際腫瘤學(xué)雜志. 2014 (06)
[8]慢病毒載體介導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)CD163的PAM細(xì)胞系的建立及對PRRSV感染的研究[J]. 王向鵬,魏蕊芳,肖書奇,周恩民.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2013(11)
[9]HIV-1慢病毒載體的構(gòu)建及結(jié)構(gòu)改造[J]. 李振宇,徐開林,潘秀英,鹿群先,何徐彭,孫海英,主鴻鵠.  中華血液學(xué)雜志. 2004(09)



本文編號：3249690