正向遺傳學(xué)篩選可以揭示特定表型相對(duì)應(yīng)的遺傳基因,將生物現(xiàn)象與其相應(yīng)的遺傳因素直接聯(lián)系起來。在哺乳動(dòng)物的全基因組篩查中,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是開展正向遺傳學(xué)篩選的一種強(qiáng)大而精準(zhǔn)的方法。靶向人全基因組的sgRNA文庫在Cas9內(nèi)切酶作用下生成的突變細(xì)胞文庫是進(jìn)行表型高通量篩選的完美平臺(tái)�；谠摷夹g(shù)構(gòu)建的不同細(xì)胞文庫已廣泛應(yīng)用于多種功能型基因的篩選,包括藥物作用基因篩選、腫瘤功能基因篩選及病毒感染基因篩選等。本文已利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了人全基因組敲除的HeLa細(xì)胞文庫,并初步應(yīng)用于HIV-1感染早期宿主依賴蛋白的篩選,亦為實(shí)驗(yàn)室后續(xù)研究提供有效的高通量篩選平臺(tái)。本研究利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建敲除細(xì)胞文庫,即先將Cas9基因穩(wěn)定表達(dá)于HeLa細(xì)胞中,在確定Cas9的高效蛋白切割活性前提下再導(dǎo)入人全基因組sgRNA文庫構(gòu)建敲除細(xì)胞庫,以確保更低的脫靶效率。本研究分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)部分:1.構(gòu)建HeLa-Cas9細(xì)胞系。通過慢病毒載體系統(tǒng),建立了穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的HeLa細(xì)胞系,利用流式分選細(xì)胞術(shù)獲得9株表達(dá)Cas9的單克隆細(xì)胞系。之后利用pXPR-011質(zhì)粒（該質(zhì)... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas系統(tǒng)分類示意圖(Khanetal.,2018)

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章緒論3Pougachetal.,2010)。（3）干擾（Interference）階段：成熟的crRNA招募Cas9蛋白特異性切割外源DNA，從而觸發(fā)入侵噬菌體的DNA序列降解(Garneauetal.,2010,Hilleetal.,2018)。Cas9核酸酶包含HNH和RuvC兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域激活時(shí)，HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割互補(bǔ)鏈，而RuvC結(jié)構(gòu)域剪切非互補(bǔ)鏈(Jiangetal.,2017)。原間隔鄰近基序（Protospaceradjacentmotif,PAM）在干擾階段是至關(guān)重要的，因?yàn)镃as9蛋白在識(shí)別和切割外源核酸的過程中，需要先識(shí)別PAM，并在PAM上游3bp處形成雙鏈斷裂（DSB），造成外源基因的沉默(Mojicaetal.,2009)。圖1-2CRISPR/Cas細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的三個(gè)階段：獲取，crRNA合成和干擾(Carteretal.,2015)Fig.1-2ThethreestagesoftheCRISPR/Casbacterialadaptiveimmunesystem:acquisition,crRNAbiogenesisandinterference1.2CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的主要作用機(jī)制是由Cas9核酸酶介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂，Martin等證實(shí)crRNA-tracrRNA復(fù)合物在Cas9發(fā)揮功能時(shí)是不可或缺的，因此運(yùn)用化學(xué)合成的方法構(gòu)建單個(gè)導(dǎo)向RNA（SingleguideRNA,sgRNA）。sgRNA包含crRNA-tracrRNA復(fù)合物配對(duì)序列及與靶基因互補(bǔ)的20nt序列，研究證實(shí)sgRNA同樣可以結(jié)合Cas9蛋白發(fā)揮作用(Jineketal.,2012)。1.2.1CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)工作原理CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行一系列的優(yōu)化改造形成的基因編輯技術(shù)，主要由Cas9蛋白和sgRNA兩部分構(gòu)成。

下，Cas9蛋白識(shí)別PAM序列，然后在PAM上游3bp形成雙鏈斷裂（DSB）。機(jī)體啟動(dòng)DSB修復(fù)機(jī)制，通常通過非同源末端連接（Non-homologousendjoining,NHEJ）或同源重組修復(fù)（Homologydirectedrepair,HDR）兩種方式進(jìn)行修復(fù)。在未有外源模板（Donor）時(shí)，NHEJ途徑是哺乳動(dòng)物DNA修復(fù)機(jī)制的主要形式(Devkota,2018)。但是NHEJ容易出錯(cuò)，在大多數(shù)情況下會(huì)缺失或者增加DNA序列造成移碼突變，導(dǎo)致編碼序列無法表達(dá)正常蛋白(Hugetal.,2016)。少數(shù)情況下，在有外源模板存在時(shí)，機(jī)體通過HDR修復(fù)實(shí)現(xiàn)精確的突變修復(fù)(Kakarougkasetal.,2014)。圖1-3CRISPR/Cas9通過非同源末端連接或同源重組修復(fù)介導(dǎo)基因組編輯(Cruzetal.,2018)Fig.1-3CRISPR/Cas9-mediatedgenomeeditingvianon-homologousend-joiningorhomologydirectedrepair1.2.2CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用2013年，兩個(gè)研究小組首次成功改造CRISPR/Cas9系統(tǒng)以完成在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因組的編輯(Congetal.,2013,Malietal.,2013)。隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的逐漸完善和成熟，其在干細(xì)胞工程、癌癥治療和疾病動(dòng)物建模等諸多領(lǐng)域都有應(yīng)用。干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，通過體外誘導(dǎo)可分化為任何類型的組織器官，在疾病治療和研究胚胎發(fā)育機(jī)制方面有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。Duchenne型肌營養(yǎng)不良（DMD）是由DMD基因突變而造成的基因功能喪失的疾玻研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)提供正確的Donor模板，在DSB修復(fù)時(shí)以糾正DMD患者來源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Inducedpluripotentstemcells,iPSCs）中的等位基因。iPSCs分化為骨骼肌細(xì)胞，表達(dá)正常功能的肌萎縮蛋白(Kyrychenkoetal.,2017,Lietal.,2015,Longetal.,2018,Youngetal.,2016)。


本文編號(hào)：3229979