利用PCR產(chǎn)物單克隆測序的方法,對3個垂穗披堿草材料的葉綠體基因組非編碼區(qū)序列trnL-F和線粒體基因nad4片段進行了變異分析。結(jié)果表明:在同一個個體中可以檢出1個以上的trnL-F和nad4變異型,不同變異型在不同材料中占比不同;在3個垂穗披堿草材料的38個克隆序列中共檢測到7種trnL-F變異型,7種變異型中共檢測到13個突變位點,共有14個突變,變異型突變以堿基轉(zhuǎn)換為主（92.3%）,變異型1為3個材料的共享類型,在3個材料所測克隆中占比分別為53.3%、100%和61.1%;在3個材料的62個克隆序列中共檢測到17種nad4變異型,17種變異型中檢測到變異位點55個,變異型突變以堿基轉(zhuǎn)換（58.2%）和堿基顛換為主（34.5%）,變異型2為3個材料的共享類型,在3個材料所測克隆中占比分別為68.4%、15.0%和13.0%,另外有11個變異型為2個材料所共享類型。 

【文章來源】：中國草地學(xué)報. 2020,42(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

葉綠體與線粒體基因組PCR擴增片段測序波峰圖

因推測細胞質(zhì)基因PCR擴增產(chǎn)物目標條帶中可能包含有不止1條序列,因此對來自同一個個體的PCR產(chǎn)物進行回收純化,然后對產(chǎn)物進行連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌培養(yǎng),挑取單克隆進行常規(guī)測序, 結(jié)果測序峰圖規(guī)則,波峰和波谷清晰,無套峰存在(圖3)。對材料nw6-5的trnL-F和nad4基因片段各10個以上克隆測序結(jié)果的初步分析表明,不同克隆間目標序列同源性并不為100%,存在SNP變異序列。由于在獲取目標序列的過程中要經(jīng)過基因組PCR擴增、目標序列克隆等分子生物學(xué)操作過程,有必要進一步排除PCR擴增偏差或序列克隆過程中有可能產(chǎn)生的人為誤差。2.3 PCR產(chǎn)物單克隆測序誤差結(jié)果排除

以垂穗披堿草總基因組DNA為模板,對3個垂穗披堿草個體分別用trnL-F和nad4引物(表1)進行葉綠體tRNA基因trnF-L區(qū)段以及線粒體乙酰脫氫酶基因nad4區(qū)段的擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,條帶清晰單一(圖1)。所擴增的葉綠體片段長度為600bp左右,線粒體片段長度為500bp左右,符合預(yù)期目標片段大小(表1)。對經(jīng)瓊脂糖檢測合格的PCR產(chǎn)物進行測序,將所測序列進行序列人工校對時發(fā)現(xiàn)測序峰圖規(guī)則,波峰和波谷清晰,但是部分個體序列中有明顯的套峰存在(圖2)。排除是測序起始或結(jié)束時所產(chǎn)生的測序錯誤,認為某些序列中的套峰為真實存在。由于PCR產(chǎn)物是在1%瓊脂糖凝膠中進行檢測,類凝膠很難對幾個bp的差異進行區(qū)分,更不能區(qū)分單核苷酸(SNP)差異,因此推測利用基因組DNA進行細胞質(zhì)基因擴增的產(chǎn)物可能并不為單一的序列。將PCR產(chǎn)物所測序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對,結(jié)果所測trnL-F和nad4序列與數(shù)據(jù)庫中trnL-F和nad4的序列相似性在96%～100%之間,表明所獲目標序列正確。圖2 葉綠體與線粒體基因組PCR擴增片段測序波峰圖

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3226481