結(jié)核分枝桿菌具有獨特的細胞壁結(jié)構(gòu),與病原菌致病性息息相關。其中,最具代表性的成分是結(jié)核菌醇蠟分支酸酯（PDIM）,它位于細菌細胞壁的表面,對維持細胞壁的完整性十分重要。同時,PDIM也是結(jié)核分枝桿菌重要的毒力因子之一,它的生物合成和轉(zhuǎn)運對細菌感染宿主以及感染后在宿主胞內(nèi)的存活發(fā)揮了不可或缺的重要作用。但是,目前我們對于PDIM代謝基因的表達調(diào)控了解得非常少,直接相關的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子尚未鑒定。本研究利用M.bovis BCG為模式菌株,首次發(fā)現(xiàn)和鑒定了轉(zhuǎn)錄因子HpoR可以直接調(diào)控PDIM合成基因簇的表達,具體結(jié)果如下:（1）利用凝膠阻滯實驗（EMSA）以及染色質(zhì)免疫沉淀實驗（ChIP）證明了HpoR在M.bovis BCG細菌體內(nèi)以及體外均能與PDIM操縱子的啟動子bcg₂950p結(jié)合,而且這種結(jié)合具有明顯的序列特異性;（2）通過設計、制備涵蓋不同長度的bcg₂950p DNA片段,EMSA實驗發(fā)現(xiàn)HpoR特異性結(jié)合在bcg₂950p的P1區(qū)段,進一步測序分析發(fā)現(xiàn)其中含有一個保守的反向回文結(jié)構(gòu);（3）β-半乳糖苷酶活性實驗及... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 分枝桿菌與分枝桿菌細胞壁
        1.1.1 分枝桿菌與結(jié)核病
        1.1.2 分枝桿菌細胞壁
    1.2 分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子家族概述
        1.2.2 TetR家族轉(zhuǎn)錄因子
        1.2.3 分枝桿菌的脂質(zhì)調(diào)控
        1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子HpoR
    1.3 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料與試劑
        2.1.1 供試菌株與細胞
        2.1.2 供試質(zhì)粒
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 實驗所用引物
        2.1.5 抗生素和酶
        2.1.6 細胞實驗相關試劑
        2.1.7 其他主要試劑配方
    2.2 實驗方法
        2.2.1 基因克隆
        2.2.2 蛋白質(zhì)表達純化、透析及檢測
        2.2.3 細菌總蛋白的提取與純化
        2.2.4 轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性分析
        2.2.5 靶基因鑒定和分析
        2.2.6 細胞表型的研究
3 結(jié)果與分析
    3.1 HpoR靶基因的鑒定
        3.1.1 轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)HpoR參與調(diào)控脂代謝相關基因的表達
        3.1.2 定量蛋白質(zhì)組學證實HpoR調(diào)控PDIM代謝相關酶的表達
        3.1.3 組學聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)HpoR調(diào)控PDIM基因簇
    3.2 HpoR基因克隆和蛋白質(zhì)純化
    3.3 HpoR特異性結(jié)合bcg_2950p調(diào)控PDIM操縱子表達
        3.3.1 凝膠阻滯實驗(EMSA)證明HpoR特異性結(jié)合啟動子bcg_2950p
        3.3.2 染色質(zhì)免疫沉淀實驗證明HpoR在體內(nèi)能結(jié)合bcg_2950p
    3.4 HpoR作為阻遏子負調(diào)控靶基因的表達
        3.4.1 β-半乳糖苷酶活實驗證實Hpo R是一個抑制子
        3.4.2 q RT-PCR實驗證實Hpo R負調(diào)控下游靶基因的表達
    3.5 HpoR抑制細菌的胞內(nèi)生存能力
    3.6 HpoR抑制炎癥相關細胞因子的產(chǎn)生
    3.7 HpoR促進細胞凋亡和活性氧的產(chǎn)生
        3.7.1 HpoR可以促進細胞凋亡
        3.7.2 HpoR可以促進活性氧(ROS)的產(chǎn)生
4 總結(jié)與討論
    4.1 總結(jié)
    4.2 討論
        4.2.1 細菌細胞壁與宿主免疫反應
        4.2.2 HpoR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及免疫調(diào)節(jié)功能
    4.3 展望
參考文獻
致謝



本文編號：3207838