水稻是世界上最主要的糧食作物之一,其能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存于胚乳中,胚乳的發(fā)育直接影響各物質(zhì)的合成和積累。目前對(duì)于調(diào)控胚乳發(fā)育的精細(xì)通路還不是很清楚,因此,加快研究胚乳發(fā)育過(guò)程具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定點(diǎn)編輯編碼異淀粉酶1的基因ISA1,獲得T₀代純合突變體,并對(duì)表型穩(wěn)定的T₁代純合突變體進(jìn)行研究,主要結(jié)果如下:1.獲得T₀代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗。在ISA1基因上設(shè)計(jì)合適的靶位點(diǎn),將構(gòu)建好的VK005載體通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中,然后將農(nóng)桿菌導(dǎo)入中花11的愈傷組織中,并獲得T₀代轉(zhuǎn)基因苗,經(jīng)潮霉素鑒定以及測(cè)序分析,共獲得7種突變類型,我們選取表型穩(wěn)定的T₁代純合突變體cr-isa1-1（type1,單堿基插入）和cr-isa1-2（type3,單堿基缺失）作為研究對(duì)象。2.T₁代突變體農(nóng)藝性狀發(fā)生變化。與野生型相比,兩個(gè)突變體籽粒表現(xiàn)褶皺,籽長(zhǎng)分別增加6.1%和5.8%,粒厚分別減少13.3%和15.4%,千粒重分別降低43.6%... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 胚乳發(fā)育與稻米品質(zhì)的關(guān)系
        1.1.1 胚乳發(fā)育與外觀品質(zhì)
        1.1.2 胚乳發(fā)育與加工品質(zhì)
        1.1.3 胚乳發(fā)育與蒸煮食味品質(zhì)
        1.1.4 胚乳發(fā)育與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)
    1.2 胚乳發(fā)育與相關(guān)基因研究進(jìn)展
        1.2.1 胚乳與外觀品質(zhì)相關(guān)基因
            1.2.1.1 粒型
            1.2.1.2 堊白
        1.2.2 胚乳與蒸煮食味品質(zhì)相關(guān)基因
        1.2.3 ISA1基因研究進(jìn)展
        1.2.4 胚乳與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)相關(guān)基因研究進(jìn)展
    1.3 基因編輯技術(shù)
        1.3.1 ZFNs技術(shù)
        1.3.2 TALENs技術(shù)
        1.3.3 CRISPR/Cas9技術(shù)
    1.4 本實(shí)驗(yàn)研究目的
第二章 載體構(gòu)建及基因編輯檢測(cè)
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 水稻材料
        2.1.2 質(zhì)粒載體
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 敲除載體的構(gòu)建
            2.2.1.1 ISA1靶序列的選擇與引物設(shè)計(jì)
            2.2.1.2 oligo二聚體插入到載體中
        2.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
        2.2.3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株驗(yàn)證
        2.2.4 突變植株的基因檢測(cè)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 靶位點(diǎn)的選擇和引物設(shè)計(jì)
        2.3.2 載體的鑒定
        2.3.3 基因編輯結(jié)果
    2.4 小結(jié)
第三章 突變體isa1的表型鑒定及功能分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 農(nóng)藝性狀的考查
        3.1.2 電鏡觀察水稻籽粒淀粉顆粒的變化
        3.1.3 稻米淀粉含量的測(cè)定
            3.1.3.1 總淀粉的測(cè)定
            3.1.3.2 直鏈淀粉的測(cè)定
        3.1.4 糊化溫度的測(cè)定
        3.1.5 膠稠度的測(cè)定
        3.1.6 鏈長(zhǎng)分布的測(cè)定
        3.1.7 碘染水稻橫截面
        3.1.8 淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)水平
            3.1.8.1 水稻種子RNA的提取方法
            3.1.8.2 合成CDNA
            3.1.8.3 Real-timePCR
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 農(nóng)藝性狀考查
        3.2.2 突變體胚乳淀粉顆粒合成異常
        3.2.3 胚乳理化指標(biāo)的檢測(cè)
        3.2.4 淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)分析
    3.3 小結(jié)
        3.3.1 突變體的農(nóng)藝性狀和胚乳淀粉顆粒發(fā)生變化
        3.3.2 突變體胚乳淀粉的理化性質(zhì)發(fā)生顯著變化
        3.3.3 淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生顯著性變化
第四章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]水稻堊白基因OsBT1的圖位克隆與功能研究[D]. 李三峰.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2017



本文編號(hào)：3205399