隨著全球石化能源總量不斷地減少,人類需求不斷地增加,尋找新的替代能源是人類必須要解決的重大問題,生物燃料乙醇以其綠色環(huán)保、可再生等特點得到人們廣泛的關(guān)注,中國已成為世界上繼巴西、美國之后第三大生物燃料乙醇生產(chǎn)國和應(yīng)用國。目前,世界上生產(chǎn)的燃料乙醇幾乎全部都是由釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生的,可見高性能的釀灑酵母菌株是燃料乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。發(fā)酵過程中,釀酒酵母細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力以及對發(fā)酵環(huán)境中各種不利因素的耐受性是酵母細(xì)胞工業(yè)應(yīng)用的重要指標(biāo)。因此,獲得乙醇發(fā)酵能力和耐受性增強的釀酒酵母菌株以及研究其高產(chǎn)和耐受的生理機制是一項非常有意義的工作。高濃度糖造成的高滲壓力是釀酒酵母細(xì)胞工業(yè)應(yīng)用中常遇到的一種環(huán)境壓力,早期對酵母耐高滲機制的研究主要是針對鹽和山梨醇形成的高滲環(huán)境,對高濃度糖形成的高滲耐受機制研究還不多。本研究以實驗室之前篩選并保存的糖蜜乙醇發(fā)酵高產(chǎn)野生釀酒酵母菌株MF02為出發(fā)菌株,對其進行紫外誘變,篩選獲得一株在40%（W/V）葡萄糖壓力下生長和發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力都比出發(fā)菌株提高的突變菌株UV02_HG。經(jīng)測定,在YPD培養(yǎng)基中兩菌株的生長曲線基本一致,突變菌株的平均... 

【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：151 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 釀酒酵母糖發(fā)酵研究的發(fā)展史
    1.2 綠色新能源-燃料乙醇
    1.3 影響釀酒酵母乙醇發(fā)酵的因素
    1.4 釀酒酵母耐高滲機制的研究
        1.4.1 HOG途徑上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制
        1.4.2 HOG途徑下游適應(yīng)性應(yīng)答
    1.5 基因表達量測定方法的發(fā)展
        1.5.1 Northern 印跡法
        1.5.2 RT-PCR
        1.5.3 微列陣芯片技術(shù)
        1.5.4 RNA-Seq
    1.6 酵母基因功能研究方法
    1.7 立項依據(jù)和研究內(nèi)容
    1.8 技術(shù)路線
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 菌種培養(yǎng)與保存
        2.1.4 酶與試劑
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 紫外誘變及篩選
        2.2.2 菌株在YPD培養(yǎng)基中生長曲線的測定
        2.2.3 菌株在YP40培養(yǎng)基中生長曲線和發(fā)酵曲線的測定
        2.2.4 菌株在不同濃度葡萄糖固體培養(yǎng)基上的生長情況
        2.2.5 菌株乙醇耐受性的檢測
        2.2.6 RNA的提取及質(zhì)量檢測
        2.2.7 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析
        2.2.8 熒光定量PCR檢測
        2.2.9 菌株相對呼吸強度的檢測
        2.2.10 高糖脅迫下細(xì)胞膜透性的檢測
        2.2.11 利用Cre/LoxP系統(tǒng)對STE12和TUP1基因進行敲除
        2.2.12 敲除株性狀變化檢測
        2.2.13 STE12和TUP1基因的回補表達
        2.2.14 回補表達菌株性狀的檢測
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 紫外誘變菌株的篩選
    3.2 菌株UV02_HG和MF02在YPD培養(yǎng)基中的生長曲線
    3.3 菌株UV02_HG和MF02在YP40培養(yǎng)基中的生長和發(fā)酵曲線
    3.4 菌株MF02和UV02_HG在不同濃度葡萄糖固體培養(yǎng)基上的生長情況
    3.5 菌株MF02和UV02_HG乙醇耐受性的檢測
    3.6 RNA提取及質(zhì)量檢測
    3.7 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析
        3.7.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析
        3.7.2 與參考基因組比對情況
        3.7.3 表達差異分析
        3.7.4 KEGG分析
        3.7.5 GO分析
        3.7.6 SNP分析
        3.7.7 PheNetic網(wǎng)絡(luò)分析
    3.8 熒光定量PCR驗證
    3.9 高糖壓力下突變株UV02_HG和野生菌株MF02相對呼吸強度的檢測
    3.10 高糖壓力下突變菌株UV02_HG和野生菌株MF02細(xì)胞膜透性的變化
    3.11 STE12和TUP1基因的敲除
        3.11.1 兩個基因的擴增
        3.11.2 敲除系統(tǒng)的構(gòu)建
        3.11.3 釀酒酵母UV02_HG菌株單倍體細(xì)胞的制備
        3.11.4 敲除株的篩選及驗證
        3.11.5 單倍體敲除株的復(fù)倍
        3.11.6 二倍體敲除株的消抗
    3.12 基因缺失菌株的性狀檢測
        3.12.1 基因缺失菌株在YPD培養(yǎng)基中的生長曲線
        3.12.2 基因缺失菌株在YP40中的生長和發(fā)酵曲線
        3.12.3 基因缺失菌株在不同濃度葡萄糖固體培養(yǎng)基上的生長情況
        3.12.4 基因缺失菌株乙醇耐受性的檢測
        3.12.5 基因缺失菌株相對呼吸強度的檢測
        3.12.6 基因缺失菌株在高糖壓力下細(xì)胞膜透性的檢測
    3.13 STE12和TUP1基因的回補表達
        3.13.1 STE12和TUP1的擴增
        3.13.2 表達組件的構(gòu)建
        3.13.3 同源置換片段的轉(zhuǎn)化及篩選
    3.14 回補菌株性狀變化的檢測
        3.14.1 基因缺失和基因回補菌株在YPD中的生長曲線
        3.14.2 基因缺失和基因回補菌株在YP40中的生長和發(fā)酵曲線
        3.14.3 基因缺失和基因回補菌株相對呼吸強度的檢測
        3.14.4 基因缺失和基因回補菌株細(xì)胞膜透性的檢測
第四章 討論
    4.1 野生釀酒酵母菌株MF02和突變菌株UV02_HG性狀及表達差異分析
        4.1.1 核糖體
        4.1.2 線粒體和氧化磷酸化
        4.1.3 糖代謝途徑
        4.1.4 MAPK途徑
        4.1.5 蛋白加工及運輸
        4.1.6 突變菌株性狀誘發(fā)因子分析
    4.2 STE12和TUP1基因?qū)︶劸平湍妇昴透咛切誀畹挠绊懠肮δ芊治?br>        4.2.1 STE12基因
        4.2.2 TUP1基因
第五章 總結(jié)
參考文獻
附錄
    附錄Ⅰ 部分試劑的配置
    附錄Ⅱ 部分基因測序序列
    附錄Ⅲ 部分實驗結(jié)果
致謝
攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]中國燃料乙醇發(fā)展現(xiàn)狀及對石油行業(yè)的影響[J]. 費華偉,王利寧,赫春燕,陳蕊.  國際石油經(jīng)濟. 2017(11)
[2]兩株高糖分利用能力的釀酒酵母呼吸突變體選育[J]. 韋緣,張穗生,陳東,陸琦,陳英,黃日波.  生物技術(shù)通報. 2012(07)
[3]氧化磷酸化抑制劑對光滑球擬酵母糖酵解速度的影響[J]. 劉立明,陳堅,李華鐘,李寅.  生物化學(xué)與生物物理進展. 2005(03)



本文編號：3194082