棉花是世界重要經濟作物之一,棉籽油的生產和棉纖維的供給對于工商業(yè)都具有非凡的意義。在我國,棉花同樣是重要的農業(yè)經濟作物,然而,基于我國耕地面積緊張、人口基數大的國情,棉花的種植面積極為受限,糧棉爭地矛盾突出。開花意味著植物開始以生殖生長為生長中心,早花可以促進早熟,實現植物生育期的縮短。因此,從棉花花期調控角度入手,攻克棉花開花調控關鍵機制,實現棉花優(yōu)質短季棉的培育是緩解當前土地局勢,優(yōu)化農業(yè)種植結構,實現高產高效的重要方法之一。前人研究表明,花期調控已逐步研究解析多種調控路徑,每個路徑都有其關鍵基因所在,例如FLC基因在春化途徑中具有重要作用,對成花起著負調控的作用;CO基因在光周期途徑中具有重要意義,是外界光周期變化與植物自身開花調控的維系等。本實驗從棉花花芽啟動的關鍵時期入手,通過轉錄組測序、超表達技術、CRISPR/Cas9基因編輯技術、matting法酵母文庫篩選實驗技術和亞細胞定位技術等手段,進行從面到點的分析研究,主要研究成果如下:（1）通過將花芽形成過程進行時期切割,細分為花芽未分化、即將分化、開始分化和分化完成四個時期,以轉錄組測序的技術手段,關注花芽形成過程中轉錄組... 

【文章來源】：山東農業(yè)大學山東省

【文章頁數】：78 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 花的形成
        1.1.1 成花誘導與成花啟動
        1.1.2 花器官發(fā)育
    1.2 開花控制途徑
        1.2.1 光周期途徑
        1.2.2 春化作用途徑
        1.2.3 赤霉素誘導途徑
        1.2.4 溫敏途徑
        1.2.5 年齡途徑
        1.2.6 自主途徑
    1.3 調控植物開花時間的相關研究現狀
    1.4 轉錄組測序技術
    1.5 酵母雙雜交系統(tǒng)
        1.5.1 酵母雙雜交系統(tǒng)
        1.5.2 核體系酵母文庫與膜體系酵母文庫
    1.6 亞細胞定位
    1.7 CRISPR/Cas9 基因編輯技術
        1.7.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現和原理
        1.7.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術的功能和應用
    1.8 本研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗時間、地點與實驗材料
        2.1.1 實驗時間和地點
        2.1.2 實驗材料
    2.2 棉花不同花芽分化時期的莖尖材料取樣
    2.3 棉花不同花芽分化時期轉錄組測序
        2.3.1 總RNA的分別提取
        2.3.2 RNA-seq文庫構建與測序
        2.3.3 序列比對與分析
        2.3.4 基因表達量統(tǒng)計與功能注釋
    2.4 超表達載體構建及轉化
        2.4.1 目的基因克隆
        2.4.2 DH5α大腸桿菌感受態(tài)制備
        2.4.3 TOPO載體構建及轉化大腸桿菌
        2.4.4 質粒小提
        2.4.5 以LR反應進行超表達載體的構建及轉化大腸桿菌
        2.4.6 農桿菌感受態(tài)制備
        2.4.7 超表達載體轉入農桿菌
        2.4.8 花粉管通道法轉化棉花并收取種子
        2.4.9 蘸花法轉化擬南芥并收取種子
    2.5 CRISPR/Cas9 基因編輯載體構建及轉化
        2.5.1 sgRNA的設計
        2.5.2 CRISPR/Cas9 表達載體的引物設計
        2.5.3 CRISPR/Cas9 插入片段的制備
        2.5.4 載體線性化
        2.5.5 一步克隆法連接插入片段與線性化載體
        2.5.6 農桿菌轉化
    2.6 matting法雙雜交文庫篩選
        2.6.1 酵母感受態(tài)制備
        2.6.2 BD載體構建
        2.6.3 誘餌基因自激活和毒性檢測
        2.6.4 matting法雙雜交文庫篩選
    2.7 亞細胞定位
3 結果與分析
    3.1 轉錄組測序數據及分析
        3.1.1 轉錄組下機數據統(tǒng)計
        3.1.2 測序質量評估
        3.1.3 基于表達量的測序評估
        3.1.4 樣品相關性分析
        3.1.5 基因表達差異分析
        3.1.6 差異表達基因的GO富集分析
        3.1.7 差異表達基因的KEGG Pathway富集分析
        3.1.8 可變剪切及新轉錄本分析
        3.1.9 基于表達量的差異基因分析與候選基因選定
    3.2 候選基因的表達模式驗證和分析
        3.2.1 轉錄組測序數據驗證
        3.2.2 不同組織和處理條件下候選基因的表達模式分析
    3.3 候選基因的超表達實驗
        3.3.1 候選基因的克隆
        3.3.2 表達載體的構建和檢驗
        3.3.3 表達載體的遺傳轉化
    3.4 候選基因的CRISPR/Cas9 基因編輯實驗
        3.4.1 靶標選擇和引物設計
        3.4.2 表達載體的構建
        3.4.3 表達載體的驗證和轉化
        3.4.4 表達載體的遺傳轉化
    3.5 候選基因的matting法雙雜交文庫篩選
        3.5.1 候選蛋白的跨膜區(qū)分析
        3.5.2 誘餌基因自激活檢測和毒性檢測
        3.5.3 互作蛋白的篩選
    3.6 候選基因結構分析和亞細胞定位驗證
        3.6.1 候選蛋白的Pfam分析
        3.6.2 候選蛋白的信號肽分析
        3.6.3 候選蛋白的亞細胞定位
        3.6.4 候選蛋白的蛋白修飾分析
4 討論
    4.1 基于轉錄組測序數據的差異基因表達特征分析
    4.2 基于轉錄組測序數據的可變剪切分析
    4.3 候選基因的作用機理預測分析和蛋白互作實驗選擇
    4.4 棉花花期調控研究的重要性
5 結論
6 參考文獻
7 致謝
8 攻讀學位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]全長轉錄組測序在植物中的應用研究進展[J]. 趙陸滟,曹紹玉,龍云樹,張應華,許俊強.  植物遺傳資源學報. 2019(06)
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博士論文
[1]Split-ubiquitin膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)的構建及其應用[D]. 曹煒.復旦大學 2007

碩士論文
[1]玉米ZmHAK1與ZmCIPK23蛋白相互作用研究[D]. 趙可菡.吉林大學 2019
[2]堿蓬脫水素蛋白（SsDHN）的亞細胞定位及功能研究[D]. 馬寶月.沈陽農業(yè)大學 2019
[3]水稻miRNAs靶基因驗證瞬時表達系統(tǒng)的構建及應用[D]. 曹雅倩.中國農業(yè)科學院 2018
[4]水稻膜系統(tǒng)酵母雙雜交cDNA文庫及OsVDAC5誘餌蛋白載體的構建與鑒定[D]. 陳利維.中南民族大學 2014
[5]以腸道病毒71型3C蛋白酶為靶點的藥物篩選模型的建立及藥物篩選[D]. 秦咸蘊.曲阜師范大學 2011



本文編號：3165364